《Bone Research》：Thrombospondin 1 and 2 regulate mesenchymal progenitor cell fate and matrix organization
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本研究针对创伤后异位骨化(HO)形成机制不清的问题，聚焦血小板反应蛋白TSP1和TSP2在细胞外基质(ECM)与间充质祖细胞(MPC)相互作用中的关键作用。通过单细胞测序、空间转录组学和体内模型，发现TSP1在损伤部位的组织重塑巨噬细胞和MPCs中上调，而TSP2特异性表达于HO原基周围的MPCs。TSP1/2双敲除(DKO)小鼠HO体积显著减小，ECM排列紊乱。研究揭示了TSP1/2通过协调ECM组织和MPC分化在HO形成中的核心机制，为靶向TSP信号通路防治HO提供了新策略。
在骨科和创伤外科领域，异位骨化(Heterotopic Ossification, HO)是一种令人困扰的并发症——患者遭受严重创伤、烧伤或接受关节置换手术后，软组织中会异常形成成熟的骨组织。这种不该出现的骨头可能导致慢性疼痛、关节活动受限，严重降低生活质量。尤其令人困惑的是，HO特别倾向于在肌腱、韧带等富含胶原蛋白的结缔组织部位发生。这提示我们，细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)——那个为细胞提供支持和营养的复杂网络——及其与细胞的对话，可能是解开HO之谜的关键。
以往的研究发现，创伤后的组织微环境中，ECM的排列方式会发生显著改变，而这种改变似乎会"误导"间充质祖细胞(Mesenchymal Progenitor Cells, MPCs)——一类具有多向分化潜能的干细胞——使其误入骨形成的歧途，而非正常愈合。更有趣的是，如果通过固定受伤部位来抑制ECM的有序排列，不仅能阻止HO的发生，还能使MPCs从成骨转向成脂分化。这表明，ECM的物理结构和化学信号共同构成了决定细胞命运的"道路指示牌"。然而，这条从ECM异常到HO形成的信号通路中，谁在充当关键的"信号兵"？这个核心问题尚未得到解答。
血小板反应蛋白(Thrombospondins, TSPs)家族成员TSP1和TSP2是ECM中的重要"联络员"，它们作为基质细胞蛋白，既能与细胞表面受体结合，也能与ECM其他成分互动，调控细胞行为。在骨骼发育和损伤修复过程中，TSPs被重新激活，尤其在胶原纤维形成中发挥重要作用。其中，巨噬细胞来源的TSP1已知可通过激活基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase, MMP)、抑制一氧化氮和激活TGF-β来介导异常的胶原沉积；而TSP2对MPCs向成骨细胞分化至关重要。这些线索将TSP1和TSP2与HO联系了起来，但它们在创伤后HO形成中的具体作用机制仍是未知领域。
发表在《Bone Research》的这项研究，正是为了揭示TSP1和TSP2如何调控ECM-MPC相互作用，从而影响HO的形成与进展。研究人员整合了多种前沿技术，包括单细胞RNA测序(scRNA-seq)、空间转录组学(Visium平台)、显微CT(μCT)、二次谐波成像(SHG)以及TSP2-eGFP报告小鼠模型，在成熟的烧伤/肌腱切断(Burn/Tenotomy, B/T)小鼠HO模型上展开了系统性探究。
关键技术方法包括：利用单细胞和空间转录组学解析损伤部位的细胞异质性与基因表达时空动态；通过TSP1/2双敲除(TSP1/2 DKO)小鼠模型进行功能缺失研究；采用二次谐波生成成像评估胶原纤维排列各向异性；结合免疫荧光染色定位关键蛋白表达；并通过伪时间分析追踪MPC分化轨迹。人源数据验证使用了已发表的神经源性HO患者骨髓来源MPCs的微阵列数据集。
Thbs1和Thbs2在HO诱导损伤后上调
对损伤部位细胞的单细胞转录组分析发现，B/T损伤后Thbs1和Thbs2表达显著上调。Thbs1主要在损伤部位的巨噬细胞中高表达，伤后3天达到峰值，且在具有抗炎、促修复特征的M2样巨噬细胞中尤为丰富。这些巨噬细胞富集于ECM组织和调节相关通路。相反，Thbs2几乎仅特异性地表达于MPCs群体，伤后7天表达最高。在人类神经源性HO患者的MPCs中，THBS1和THBS2同样显著上调，表明这种血小板反应蛋白特征在物种间具有保守性。
Thbs2在HO部位周围与纤维生成相关的MPCs中特异性表达
免疫固定损伤部位会导致HO体积减小、胶原基质排列改变以及成骨减少，同时伴随着Thbs2表达的显著下调，提示机械力可能调控Thbs2表达。利用TSP2-eGFP报告系统进行空间定位，发现伤后7天和21天，HO部位和肌腱周围的TSP2-eGFP信号显著增加，与scRNA-seq结果一致。免疫荧光染色证实，损伤部位存在大量共表达血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)和TSP2的MPCs。同时，软骨形成关键转录因子SOX9阳性细胞及SOX9+TSP2+双阳性细胞在伤后7天增加，表明TSP2+ MPCs参与了软骨内成骨的早期过程。
空间转录组学揭示Thbs1和Thbs2分别在HO原基内部和周围表达
空间转录组分析提供了基因表达的精确解剖学定位。预测分数显示，巨噬细胞最可能存在于HO原基内部，而MPCs则富集于HO原基边界周围，呈现出巨噬细胞-MPCs轴的互补分布模式。与此相应，Thbs1的相对表达在HO原基内部最高，并随距离增加而降低；Thbs2则在HO原基内部表达有限，但在原基边界外显著增加并达到峰值。这种独特的空间表达模式提示TSP1和TSP2在HO形成的不同区域和阶段扮演着专门化的角色。
TSP1和TSP2协调损伤后MPC命运和ECM重塑
伪时间分析将MPCs分为三个群体：普通MPCs、ECM重塑MPCs和增殖性MPCs。损伤使MPCs的分化轨迹从稳态增殖转向ECM重塑谱系，且损伤MPCs中Thbs1和Thbs2在分化晚期显著上调。共表达网络分析将Thbs2与ECM组织和重塑相关基因(如Col12a1, Col27a1, Plod2, Mmp13)联系起来。转录因子 motif 分析发现远上游元件结合蛋白1(Far Upstream Element Binding Protein 1, FUBP1)可能是Thbs2的潜在调控因子。在肌腱MPCs中敲低Fubp1可导致Thbs2表达下降，Fubp1敲除小鼠模型和携带A38D点突变的细胞系也显示Thbs2表达降低，支持了FUBP1在调控Thbs2表达中的作用。
TSP1和TSP2缺失破坏基质结构动态并抑制体内HO形成
TSP1/2 DKO小鼠的功能研究证实了这两种蛋白的关键作用。SHG成像显示，与野生型(WT)小鼠相比，DKO小鼠在损伤6周后跟腱和HO部位的胶原纤维排列显著紊乱，各向异性值降低。显微CT定量分析发现，伤后9周，DKO小鼠的总HO体积、肌腱相关HO和骨相关HO体积均显著减少。组织学分析进一步揭示，WT小鼠HO原基周围存在由PDGFRα+细胞构成的清晰边界包绕着分化的SOX9+细胞，而DKO小鼠则缺乏这种有序结构，PDGFRα+ SOX9+双阳性细胞分布混乱。
对未受伤跟腱的转录组分析发现，DKO小鼠基线水平下多个基质体相关基因(如Plod2, Spp1, Alox12)表达下调，KEGG富集分析显示ECM-受体相互作用和黏着斑信号通路受到抑制。伤后7天，胶原交联酶(LOXL2, PLOD2)和基质重塑蛋白酶(MMP14)在DKO组织中的表达均显著低于WT对照组。这些结果表明，TSP1和TSP2的缺失导致ECM重塑能力受损，无法为成骨分化提供适宜的微环境。
研究结论与意义
本研究通过多组学整合分析，首次系统阐明了TSP1和TSP2在创伤性HO形成中的时空特异性表达模式与功能机制。TSP1由损伤核心区M2样巨噬细胞表达，参与炎症调节及早期组织重塑；TSP2由HO原基周边的MPCs特异性表达，通过FUBP1等转录因子调控ECM重塑基因网络，主导胶原纤维组装与基质成熟。两者协同作用，构建了引导MPC向成骨分化的物理化学微环境。
TSP1/2 DKO模型证实，缺失这两种蛋白会破坏ECM的有序性，关键重塑酶表达下调，最终显著抑制HO形成。这揭示了"巨噬细胞-TSP1"与"MPC-TSP2"轴在空间上分工协作，共同驱动异常骨化的新机制。
该研究不仅深化了对HO发病机制的理解，更重要的是将TSP1和TSP2确立为潜在的治疗靶点。未来研究可进一步探索细胞特异性敲除模型以解析不同细胞来源TSPs的贡献，并开发靶向TSP信号通路的新型干预策略，为预防和治疗创伤后HO及其他纤维化-骨化异常疾病提供新的思路。
