《Bone Research》：Neutrophil-initiated nociceptive ingrowth orchestrates inflammation resolution to potentiate bone regeneration
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本研究针对创伤性及炎症性骨病中伤害性疼痛的免疫调节作用不明的问题，开展了中性粒细胞-伤害性感受器轴在骨愈合中作用机制的研究。发现中性粒细胞亚群通过NGF-TrkA轴驱动TRPV1+伤害性神经长入，后者通过释放CGRP激活成骨细胞自噬，促进脂氧素A4(LXA4)生成，从而有效消退炎症。该发现为糖尿病等炎症性骨病的治疗提供了神经免疫调控新策略。
当我们不小心骨折时，剧烈的疼痛往往是最直接的感受。这种由伤害性感受器介导的疼痛，长期以来被视为炎症的被动副产品。然而，近年来科学家们开始思考一个有趣的问题：这种疼痛是否不仅仅是简单的警报信号，而是主动参与组织修复的调节者？特别是在骨愈合过程中，早期炎症反应的适度控制对后续的骨再生至关重要。非甾体抗炎药(NSAIDs)对骨愈合的负面影响提示我们，伤害性神经的激活可能对骨修复具有积极作用。
在这项发表于《Bone Research》的研究中，上海交通大学医学院附属第九人民医院的齐璇宇、杨光正、徐泽乾等研究人员深入探讨了伤害性感受器在骨愈合早期的免疫调节作用。他们发现了一个精妙的负反馈调节机制：中性粒细胞启动的伤害性神经长入反过来约束炎症反应，为骨再生创造有利环境。
研究人员首先在小鼠股骨缺损模型中观察到，TRPV1+伤害性神经在损伤后第3天开始长入，第7天达到高峰。有趣的是，尽管神经长入最为显著，但小鼠的疼痛行为却在第7天明显缓解。这一矛盾现象提示伤害性神经长入可能与炎症消退相关。通过药理学和遗传学方法特异性消融TRPV1+伤害性神经后，研究人员发现损伤部位炎症因子异常升高，中性粒细胞浸润增加，并形成大量中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，最终导致骨再生受损。这些结果说明伤害性神经长入在骨愈合早期起到限制炎症的"刹车"作用。
为了阐明这一现象背后的细胞机制，研究人员通过单细胞RNA测序技术分析了损伤部位的免疫细胞组成。结果显示，中性粒细胞是神经营养因子的主要来源，而非之前报道的巨噬细胞。通过特异性清除中性粒细胞或巨噬细胞的实验进一步证实，中性粒细胞而非巨噬细胞，是驱动伤害性神经长入的关键细胞。
机制研究发现，损伤后第5天的中性粒细胞条件培养基能显著促进背根神经节(DRG)神经元的轴突生长和钙内流。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选，研究人员确定神经生长因子(NGF)是介导这一过程的关键分子。在TRPV1+神经元中条件性敲低NGF受体TrkA基因，可阻断中性粒细胞介导的伤害性神经长入，证明中性粒细胞通过NGF-TrkA轴启动伤害性神经长入。
那么，伤害性神经又是如何反馈调节炎症的呢？研究人员将目光投向了专门的促消退介质(SPMs)，特别是脂氧素A4(LXA4)。他们发现，伤害性神经消融后，LXA4水平显著下降，而这一变化并非由于LXA4合成酶的表达改变，而是与自噬过程受损相关。进一步实验表明，伤害性神经主要通过释放降钙素基因相关肽(CGRP)激活成骨细胞中的自噬，从而促进LXA4的生物合成。
深入机制探索发现，CGRP通过激活PKA/LKB1/AMPK/ULK1信号级联，诱导成骨细胞自噬。自噬通过清除活性氧(ROS)，抑制CaMKII介导的5-脂氧合酶(5-LOX)磷酸化，阻止其核转位，从而促进LXA4的合成而非促炎性白三烯的产生。
研究的临床意义在糖尿病骨愈合模型中得到了验证。通过分析糖尿病患者牙槽骨转录组数据，研究人员发现神经支配减少与自噬水平下降、炎症加剧和骨形成受损相关。相应地，通过三种策略激活伤害性神经——移植健康小鼠的中性粒细胞、辛辣饮食或局部使用TRPV1激动剂辣椒素，均能有效促进糖尿病小鼠拔牙创的愈合。
本研究的主要技术方法包括：建立小鼠股骨缺损和拔牙创模型，通过免疫组化、免疫荧光等技术分析神经支配和细胞变化；采用单细胞RNA测序和批量RNA测序技术解析细胞异质性和基因表达谱；通过体外细胞培养、钙成像、RNA干扰等技术验证分子机制；使用微CT、组织学染色评估骨再生效果；其中人类牙槽骨样本来自GEO数据库(GSE182923)。
研究结果
TRPV1+伤害性神经支配促进炎症消退
研究人员发现，在骨愈合过程中，伤害性神经长入与炎症消退呈负相关。消融TRPV1+伤害性神经导致炎症因子异常升高和中性粒细胞过度浸润，最终损害骨再生。这表明伤害性神经在骨愈合早期起到限制炎症的关键作用。
中性粒细胞与伤害性感受器之间的负反馈环路
单细胞RNA测序分析显示，中性粒细胞是神经营养因子的主要来源。清除中性粒细胞显著抑制了伤害性神经长入，而清除巨噬细胞影响较小。这表明中性粒细胞启动的伤害性神经长入作为负反馈，约束中性粒细胞浸润，触发骨修复。
中性粒细胞通过NGF-TrkA轴启动伤害性神经长入
损伤后第5天的中性粒细胞条件培养基显著促进DRG神经元轴突生长，其中NGF上调最为显著。在TRPV1+神经元中条件性敲低Ntrk1基因，可阻断中性粒细胞介导的伤害性神经长入，证明中性粒细胞通过NGF-TrkA轴启动伤害性神经长入。
神经营养因子合成中性粒细胞的表征
通过单细胞RNA测序，研究人员鉴定出一个独特的Il4ra+Ccl2high中性粒细胞亚群，该亚群表达初级和次级颗粒基因，具有强增殖能力，类似于中性粒细胞前体细胞，是神经营养因子的主要来源。
伤害性感受器通过自噬促进成骨细胞LXA4生物合成以抑制中性粒细胞炎症
伤害性神经消融后，LXA4水平显著下降，自噬过程受损。抑制自噬可降低LXA4水平，表明自噬是伤害性神经介导LXA4分泌所必需的。单细胞RNA测序显示，自噬相关基因主要在成骨细胞系中表达。
伤害性感受器通过CGRP重塑炎症微环境
遗传消融TRPV1+伤害性神经导致CGRP和P物质(SP)水平急剧下降，炎症平衡被打破。外源性CGRP而非SP可逆转伤害性神经消融引起的异常炎症。在成骨细胞中条件性敲低CGRP受体RAMP1基因，可抑制自噬和LXA4生成，导致炎症失控。
CGRP触发的自噬挽救ROS阻断的LXA4合成
中性粒细胞条件培养基可提高成骨细胞内ROS水平，抑制LXA4分泌。激活的DRG条件培养基通过CGRP-RAMP1信号激活自噬，清除ROS，促进LXA4生成。这一过程涉及PKA/LKB1/AMPK/ULK1信号级联的激活。
自噬限制5-LOX核定位以促进LXA4合成
CGRP通过激活自噬，清除ROS，抑制CaMKII介导的5-LOX磷酸化，阻止其核转位，从而促进LXA4的合成。抑制CaMKII或使用过氧化氢酶清除ROS，均可促进LXA4生物合成。
激活伤害性感受器促进糖尿病小鼠牙槽骨愈合
分析糖尿病患者牙槽骨转录组数据发现，神经支配减少与自噬水平下降、炎症加剧和骨形成受损相关。通过三种策略激活伤害性感受器——中性粒细胞过继转移、辛辣饮食或局部使用TRPV1激动剂，均可有效促进糖尿病小鼠拔牙创愈合，减轻炎症，促进骨再生。
