Rps19R67Δ突变构建Diamond–Blackfan贫血模型并揭示p53通路下游介质

《HemaSphere》：Rps19R67? mutation creates a model of Diamond–Blackfan anemia and reveals downstream mediators of p53 pathway

本研究通过构建Rps19基因R67位点缺失（Rps19R67Δ）的小鼠模型，成功模拟了Diamond–Blackfan贫血（DBA）的血液学异常及多系统发育缺陷。模型显示该突变通过干扰核糖体RNA（rRNA）加工激活p53信号通路，导致红系造血障碍。研究通过竞争性移植实验和单细胞测序证实p53缺失可逆转造血缺陷，为核糖体病治疗策略开发提供了重要模型。

　　

引言

Diamond–Blackfan贫血（DBA）是一种以红系造血衰竭为特征的罕见遗传病，常伴发心血管、骨骼和泌尿生殖系统异常。约25%病例由核糖体小亚基蛋白19（RPS19）基因突变引起。本研究通过转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术构建了Rps19基因第67位精氨酸缺失（Rps19^R67Δ）的小鼠模型，该位点位于人类RPS19蛋白的α-螺旋3热点区域（残基52-67）。

模型构建与表征

R67缺失突变（c.495_498delCCGAinsG）未改变阅读框，但破坏了RPS19与18S rRNA的阳离子-π堆积相互作用（图1B）。纯合突变小鼠（Rps19^R67Δ/R67Δ）表现为生长迟缓、存活率下降（中位生存期20周）及多系统发育异常（图1C-E），包括胸椎弯曲、腹部白斑（图1F）等类似DBA患者的表型。

造血缺陷机制

纯合突变小鼠出现不同程度的贫血，伴有骨髓细胞减少和红系发育阻滞（图2A-G）。流式细胞术分析显示红系分化阶段S0-S5细胞数量显著减少（图2F-G），造血干细胞和祖细胞中Lin^?Sca1⁺c-Kit⁺（LSK）群体减少30%，短时重建造血干细胞（ST-HSC）和多能祖细胞（MPP）亚群明显受损（图2H-N）。竞争性移植实验证实Rps19^R67Δ/R67Δ造血干细胞植入能力仅为对照组的20%（图2O）。

p53通路激活与挽救实验

RNA测序发现成年突变小鼠骨髓中p53靶基因Zmat3、Phlda3、Eda2r上调（图3A），胚胎肝组织中Cdkn1a（p21）、Ccng1、Psrc1表达升高（图3B-C）。蛋白印迹显示p53积累但磷酸化水平未增加（图3D）。将Rps19^R67Δ/R67Δ与Trp53^?/?杂交后，双突变小鼠的骨髓细胞数量、LSK群体比例及造血干细胞植入能力均恢复至正常水平（图3E-K），且骨骼畸形和生长延迟被逆转（图3M）。但Trp53缺失导致小鼠寿命缩短（图3L），与p53缺失的促肿瘤效应相关。

单细胞转录组学分析

对Lin^?c-Kit⁺骨髓细胞的单细胞RNA测序揭示了36个造血群体（图4A-B）。轨迹分析显示p53靶基因在造血干细胞（HSC）阶段已开始激活（图5A-B），沿红系分化过程逐渐增强。差异表达基因验证了Zmat3、Phlda3、Eda2r、Cdkn1a、Ccng1在突变群体中的特异性上调（图4E）。

rRNA加工与翻译缺陷

突变小鼠骨髓中45S前体rRNA积累（图5C），小鼠红白血病细胞（MEL）表达RPS19^R67Δ突变体后，蛋白质合成速率下降（通过L-HPG掺入实验检测），表明该突变直接干扰核糖体功能。

讨论

Rps19^R67Δ模型首次证实p53通路激活始于造血干细胞阶段，并通过破坏rRNA加工导致红系发育障碍。Phlda3等新发现的p53下游靶点可能成为DBA的潜在治疗靶标。该模型为研究核糖体病发病机制及开发靶向p53通路的治疗策略提供了重要平台。