《iLABMED》：Tumor-Intrinsic Forkhead Box A2 Regulates the Lymph Node Metastasis of Papillary Thyroid Carcinoma by Regulating T-Cell Apoptosis
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本综述系统阐述了转录因子FOXA2在甲状腺乳头状癌（PTC）淋巴结转移（LNM）中的核心作用。研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，揭示了FOXA2通过调控CCL2/LCN2信号通路影响T细胞凋亡，从而塑造免疫抑制微环境、促进癌症转移的新机制。这项工作为理解PTC的转移机制提供了新的视角，并提示FOXA2可能成为潜在的免疫治疗靶点。
引言
肿瘤细胞转移至淋巴结（LN）与癌症患者远处转移风险升高和临床预后较差相关。新兴证据表明，转移性LN能够调节全身性抗肿瘤免疫。尤其值得注意的是，靶向LN转移已被证明能显著增强对甲状腺乳头状癌（PTC）的治疗效果，这凸显了其为改善患者生存率的关键策略。因此，治疗策略应优先靶向LN转移瘤而非原发癌（PC），以确保有效的抗肿瘤T细胞生成并及时浸润至肿瘤部位。然而，区分LN转移瘤细胞与PC细胞的独特生物学特性及其潜在机制仍不清楚。
肿瘤发展是恶性细胞与其微环境之间动态相互作用的结果。癌细胞通过下调或丢失免疫可识别蛋白（如肿瘤抗原）的表达或抑制T细胞活化来逃避LN中的免疫监视。例如，乳腺癌细胞中CXCR4表达升高被认为是LN转移和定植的关键驱动因素。具有增强迁移和免疫逃避能力的癌细胞通常表现出上调的干扰素刺激基因，包括MHC-I和PD-L1，这有助于逃避免T细胞和自然杀伤细胞介导的杀伤。尽管有这些发现，癌细胞介导LN转移的精确分子机制——特别是肿瘤细胞与免疫细胞之间的串扰——仍未完全阐明。
甲状腺癌作为一种常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率在过去十年中有所上升。大多数PTC病例预后良好。目前，标准治疗主要包括甲状腺切除术和选择性LN清扫。研究表明，PTC和甲状腺髓样癌中的LN转移主要源于肿瘤侵入已存在的甲状腺周围淋巴网络，而非通过肿瘤诱导的淋巴管生成。单细胞RNA测序（scRNA-seq）的最新进展使得能够精确表征恶性甲状腺细胞的异质性、肿瘤生态系统的组成及其动态相互作用，包括不同的免疫微环境特征。然而，需要进一步的研究来充分阐明甲状腺癌中LN转移瘤与PC之间差异发病机制的分子机制。
本研究系统地研究了肿瘤细胞的内在特征及其与肿瘤免疫微环境的动态相互作用，这些相互作用促进了LN转移和定植，特别着重于描述PTC中PC与LN转移瘤之间的根本差异。我们的结果表明，与PC部位相比，转移性LN中T细胞与癌细胞之间的串扰明显减弱，创造了一个免疫抑制生态位，促进肿瘤细胞存活。此外，我们确定叉头框A2（FOXA2）作为一个主调节因子，通过调节CCL2介导的T细胞凋亡，同时控制甲状腺癌细胞的免疫原性和转移潜力。
材料与方法
患者与人口统计学数据
PC和配对的LN样本采集自2020年在唐都医院（中国西安）接受肿瘤切除的PTC患者。患者在样本收集前提供了书面知情同意书。研究方案符合相关伦理指南，并获得了唐都医院机构研究伦理委员会的批准（伦理号：GKJ-Y-202303-065）（中国西安）。
单细胞测序与生物信息学分析
新鲜组织在术后30分钟内保存在sCelLive组织保存溶液中。使用Singleron PythoN自动化组织解离系统在37°C下消化15分钟。通过台盼蓝染色评估细胞活力。将单细胞悬浮液加载到微流体装置中，使用GEXSCOPE单细胞RNA文库试剂盒构建scRNA-seq文库。使用Seurat程序（R包v.3.0.1）分析RNA测序数据。数据使用“LogNormalize”方法进行标准化。使用UMAP可视化细胞。使用“FindMarkers”功能识别簇之间的差异表达基因（DEG）。使用clusterProfiler软件进行基因本体（GO）功能富集分析。
反卷积分析
使用CellCODE对TCGA数据库中的批量RNA-seq数据进行反卷积分析，以验证细胞比例变化。
细胞-细胞相互作用分析（CellChat）
使用CellChat（版本1.6.1）分析scRNA-seq数据中的细胞间通信网络。
细胞轨迹分析
使用Monocle2（v2.12.0）重建从正常细胞到癌细胞的单细胞轨迹。计算伪时间。
SCENIC分析和单样本基因集富集分析
使用SCENIC R工具包分析scRNA表达矩阵和AnimalTFDB中的转录因子。使用GENIE3包基于调节因子和靶标的共表达预测调节网络。使用RcisTarget包在数据中搜索转录因子结合基序。使用AUCell包计算参与预测调节网络的基因集的AUC值，以评估细胞中调节网络的活性。
细胞培养与FOXA2敲低
人PTC细胞系TPC-1和B-CPAP在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养。用含有质粒（对照和FOXA2-RNAi）的逆转录病毒感染细胞24小时，并在实验前用嘌呤霉素进行阳性选择。
细胞实验
进行了包括细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）集落形成、伤口愈合、细胞周期以及Transwell细胞迁移和侵袭测定在内的体外实验。
共培养实验
将分别从TPC-1癌细胞单层收集的条件培养基应用于接种在24孔板中的T细胞。使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒和流式细胞术评估细胞凋亡。
统计分析
数据表示为平均值±标准差（SD）。使用双尾Student t检验进行组间比较。使用Spearman等级相关分析评估连续变量之间的关联。统计显著性定义为双尾p< 0.05。所有统计分析均使用GraphPad Prism（版本8.4.3）进行。
RNAseq
使用Illumina NovaSeq 6000平台对FOXA2敲低和对照的TPC-1细胞进行RNAseq。使用DESeq2 R包进行差异表达分析。
RT-PCR
使用TRIzol试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Kit在ABI Quant Studio 5实时PCR系统上进行实时PCR，以GAPDHmRNA作为内参。
结果
LN转移瘤细胞通过单细胞转录组分析显示 distinct 特征
为了获得PTC的综合转录组图谱，我们对接受手术切除的PTC患者的PC和LN样本进行了scRNA-seq。苏木精和伊红（H&E）染色显示了转移性LN和PC的大体外观。使用UMAP，我们可视化了来自PC组织的7218个单细胞和来自LN的8373个单细胞。所有合格的细胞被分为11种主要细胞类型，包括一个被定义为癌细胞的EPCAM+KRT19+KRT18+TG+细胞簇。UMAP图显示，这些癌细胞的表达程序揭示了与其样本来源相关的 substantial distinct 异质性特征。我们随后分析了这些样本的内部组成，并通过使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库甲状腺癌组织的批量转录组谱进行反卷积分析验证了它们的细胞组成。
基于转录异质性，我们将癌细胞谱系表征为六个不同的簇。簇1和簇3主要在原发癌中检测到，而簇2和簇4主要在LN中鉴定。簇3的平均表达程序与其他五个簇的相关性较低（Pearson's R = 0.8256），表明其具有更高的癌症干细胞特征和更高的肿瘤分化评分（TDS）的独特转录谱。
我们随后进行了轨迹分析以推断PTC的LN转移过程。基于Monocle的轨迹分析产生了四个层次（状态1-4），其中簇3位于左角（状态1和2），表明这是该图谱上的细胞进化起点。轨迹似乎演变成两个癌细胞分支，末端为状态3（簇4）和状态4（簇2）。值得注意的是，我们在原发癌细胞中几乎检测到所有四个轨迹状态。然而，状态3和状态4的组成在LN癌细胞中增加，显示出恶性程序中的转移状态。状态3和状态4也以比状态1和2更低的肿瘤分化评分为特征。
LN来源的癌细胞中免疫反应激活特征占主导
接下来，我们分析了LN和PC癌细胞的差异基因表达谱。火山图显示了最显著的DEG。根据GO富集分析，与PC癌细胞相比，参与免疫反应激活信号转导的基因表达在LN中富集，而PC癌细胞中与甲状腺激素代谢过程相关的基因富集。这些发现表明，与PC相比，当癌细胞在LN中克隆时获得了特殊的免疫反应激活特征。
基因集变异分析表明，从状态1到状态4，炎症相关特征，如炎症反应、IL6-JAK-STAT3信号、干扰素-γ反应、TGF-β信号和NF-κB介导的TNF-α信号增强，而与氧化磷酸化相关的基因下调。此外，基因集富集分析表明，炎症反应、干扰素-γ反应和NF-κB介导的TNF-α信号主要在LN来源的癌细胞中激活。因此我们推测，癌细胞可能在LN的炎症相关特征中发挥重要作用。
与PC相比，LN中T细胞与其他细胞的相互作用减弱
我们随后可视化了来自原发灶和配对LN的癌细胞周围的所有其他细胞。值得注意的是，Cellchat分析表明，与原发灶相比，LN中T细胞与所有其他细胞之间的相互作用减弱。我们还分析了T细胞与其他细胞之间的趋化因子相互作用，发现无论T细胞的传入/传出信号如何，LN中CXCL/CCL、INF-II和LIGHT的水平均低于PC病灶。
FOXA2通过调节T细胞凋亡影响癌细胞淋巴结克隆
我们进行了SCENIC分析以识别调节癌细胞的上游转录因子。结果确定FOXA2是状态2中的关键调节因子。还检测到其他转录因子，如JUNB、JUND、ATF3、MAFB、RXRA、KLF12和FOS，表明它们可能在癌细胞LN转移中潜在发挥作用。对GEPIA2数据库（TCGA和GTEx数据）的分析表明，FOXA2的高表达与甲状腺癌更好的无病生存相关，并且与正常组织相比，甲状腺癌组织中的FOXA2表达显著下调。我们随后使用肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE）算法预测TCGA数据库的潜在免疫治疗反应。具有较高FOXA2表达的甲状腺癌显示出显著更高的TIDE评分，这表明免疫检查点阻断疗法的治疗效果较差，接受治疗后生存期更短。使用CIBERSORT评分，具有较高FOXA2表达的甲状腺癌中CD8+T细胞和滤泡辅助T细胞的比例较高，而调节性T细胞（Tregs）的比例较低。Spearman相关分析图也显示FOXA2表达与CD8+T细胞和滤泡辅助T细胞呈正相关，与Tregs呈负相关。
为了研究FOXA2在PTC进展中的功能相关性，我们通过敲低PTC细胞系（TPC-1和B-CPAP）中的FOXA2进行了体外实验。我们发现敲低FOXA2增加了细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
我们还使用条件培养基检查了T细胞与癌细胞之间的相互作用。当T细胞用FOXA2敲低的TPC-1细胞上清液处理时，早期凋亡和晚期凋亡的细胞增加。这表明FOXA2可能通过诱导T细胞凋亡来表征癌细胞，使其在癌细胞侵入LN时逃避免T细胞的监视。
CCL2是FOXA2诱导的癌细胞转移所必需的
为了识别FOXA2调节的潜在机制，在shNC和shFOXA2TPC-1细胞中进行了RNA-seq。与对照细胞相比，在FOXA2沉默的TPC-1细胞中，上调的基因最富集于细胞迁移相关通路，而下调的基因富集于细胞因子和配体相关通路。进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析以进一步评估参与上调基因所有富集通路的DEGs的核心基因。基于FOXA2沉默的TPC-1细胞，确定了CCL2介导的免疫相关通路。RT-PCR显示，与对照相比，FOXA2沉默的TPC-1细胞中CCL2、IL1-α和IL-33mRNA的表达下调。对来自癌细胞、簇3和FOXA2沉默的TPC-1细胞的DEGs进行Venn分析显示，LCN2基因同时存在于scRNA-seq和TPC-1 RNA-seq基因集中，PPI分析也显示其与CCL2相关。总之，我们的结果表明FOXA2调节甲状腺癌中CCL2和LCN2的表达，所涉及的基因也通过RT-PCR呈现。这可能是FOXA2通过诱导T细胞凋亡来表征癌细胞以逃避免T细胞监视的方式。
讨论
甲状腺癌中的LNM是疾病复发和死亡率的关键决定因素；然而，驱动转移进展的分子和细胞机制仍不完全清楚。我们对配对的PC和LN转移瘤的单细胞转录组分析结果为了解甲状腺癌LNM相关的细胞异质性、进化轨迹和微环境重编程提供了新的见解。在此，我们证明转移能力与一个表现出升高TDS的 distinct 癌细胞亚群（簇3）相关，该亚群进化为主导LN转移瘤。这一发现与先前的研究一致，即转移亚克隆获得独特的转录程序以适应 distant 生态位。值得注意的是，LN转移瘤中免疫反应激活细胞表面受体信号通路的富集强调了转移过程中恶性细胞与免疫微环境之间的动态相互作用。
我们研究中的一个 striking 观察是LN转移瘤内T细胞与其他细胞类型之间相互作用的减弱，以及CCL介导的信号改变。这表明转移性癌细胞可能利用趋化因子网络来调节免疫逃逸。LN转移癌细胞抵抗T细胞介导的细胞毒性并产生肿瘤特异性免疫耐受，随后促进 distant 肿瘤定植。例如，减弱的T细胞接合可能反映了受损的抗原呈递或免疫抑制检查点的激活，而CCL介导的信号可能促进调节性免疫亚群的招募或直接抑制细胞毒性T细胞活性。这些发现与新兴证据产生共鸣，即趋化因子失调有助于实体瘤中免疫许可的转移生态位。
我们机制发现的核心是FOXA2作为转移性和免疫调节程序的一个肿瘤内在调节因子的作用。在PTC细胞系中敲低FOXA2促进了癌细胞增殖和迁移以及T细胞凋亡，暗示其是侵袭性表型的抑制因子，这已在其他癌症中报道。FOXA2在肺癌、胃癌和胰腺癌中作为肿瘤转移的抑制因子发挥作用。FOXA2诱导胎儿神经内分泌基因表达程序并促进肺癌的多部位转移，并减弱乳腺癌中的上皮间质转化（EMT）。FOXA2的沉默会降低E-钙粘蛋白的表达，并与口腔癌中的LN转移相关。因此，FOXA2在LN转移中扮演双重角色，根据癌症类型的不同，既可作为肿瘤抑制因子，也可作为促进因子。
FOXA2似乎通过CCL2/LCN2轴控制T细胞活性，该通路先前与其他癌症中的免疫抑制相关。FOXA2的缺失减弱了IL-1α和IL-33的表达，两者都是IL-1家族的成员。IL-33的激活通过促进Tregs从肿瘤引流LN激活、成熟和迁移至肿瘤部位，从而抑制CD8+T细胞的抗肿瘤功能，有助于免疫抑制。值得注意的是，IL-33的免疫调节功能需要通过CCL2通路进行信号传导，并且CCL2和LCN2可能在肿瘤微环境内协同产生抑制活性。然而，FOXA2控制T细胞活性的精确机制——特别是是否涉及IL-33驱动CCL2/LCN2轴——需要进一步研究。
在临床上，我们的研究提出FOXA2作为伴有LNM的甲状腺癌的预后生物标志物和治疗靶点。恢复FOXA2活性或靶向其下游效应物可能减轻转移扩散，同时通过调节IL-33或CCL2的表达来重振抗肿瘤免疫力。然而，将这些见解转化为疗法仍面临挑战。例如，FOXA2在组织间的多效性效应需要细胞特异性靶向策略以避免脱瘤毒性。此外，患者间免疫微环境的异质性可能影响治疗反应，强调了个性化方法的必要性。
本研究有几个局限性。虽然单细胞分析的样本量足够，但可能未能充分代表罕见的亚克隆或微环境亚群。这种代表性不足可能妨碍检测对疾病进展或治疗抵抗有不成比例贡献的关键、低丰度细胞状态。此外，微环境多样性的不完全捕获可能损害关于细胞-细胞相互作用和肿瘤生态系统内功能异质性推论的稳健性。需要在体内和多样的临床前模型中功能验证FOXA2的作用以确认其机制贡献。
结论
我们的工作阐明了甲状腺癌LNM的转录和免疫景观，揭示了FOXA2作为转移-免疫串扰的关键 orchestrator。这些发现增进了我们对LN转移发病机制的理解，并为开发针对晚期甲状腺癌中肿瘤细胞和免疫失调的组合策略提供了框架。未来的研究应探索FOXA2驱动的通路是否与现有免疫疗法协同作用以改善转移性疾病患者的预后。
