《Journal of Diabetes Research》：Association of Serum Vitamin D With Macular Microvascular Structure in Type 2 Diabetic Mellitus Without Diabetic Retinopathy: A Cross-Sectional Study
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本研究通过光学相干断层扫描血管成像（OCTA）技术，首次在无糖尿病视网膜病变（DR）的2型糖尿病（T2DM）患者中，揭示了血清维生素D水平与黄斑区微血管灌注密度（PD）的显著正相关，尤其发现维生素D缺乏（VDD）组患者浅层毛细血管丛（SCP）在颞侧及上方区域的PD值显著降低，提示维生素D缺乏可能通过影响视网膜微循环参与DR的早期病理过程，为T2DM患者早期微血管病变的筛查与干预提供了新的视角和潜在靶点。
引言
糖尿病（DM）已成为全球健康领域的重大挑战，伴随高发病率和死亡率。其长期并发症之一——糖尿病视网膜病变（DR），是糖尿病患者中最常见的并发症之一，严重时可导致视力损伤甚至失明。早期筛查DR已被证明可以降低其患病率和严重程度，因此，在DR发生前进行早期评估、预测和干预至关重要。组织病理学研究表明，视网膜血管系统的改变在DR临床体征出现之前就已发生。因此，评估视网膜血流变化可能成为预测DR进展和预后的新型临床方法。
光学相干断层扫描血管成像（OCTA）是一种新兴的非侵入性成像技术，已成为视网膜血管系统定性和定量评估的关键工具，广泛用于评估DR严重程度。许多研究分析了OCTA的影像特征，如灌注密度（PD）、黄斑无血管区（FAZ）、分形维度和无灌注区等，这些特征大多与早期DR密切相关，并显示出对DR进展的重要诊断准确性和预测价值。视网膜血管是体内少数可以直接观察到的血管，利用OCTA对视网膜血管进行定量研究以预测DR严重程度和识别高危患者，可能代表临床实践中的一种新策略。
维生素D在血管保护和再生方面具有重要意义。越来越多的研究表明，维生素D缺乏（VDD）与糖尿病和DR相关。研究揭示了DR的发生和严重程度与维生素D水平之间存在负相关关系。已有研究证实，血清25(OH)D水平低于20 ng/mL的2型糖尿病（T2DM）患者发生和进展DR的风险显著更高。然而，血清维生素D水平是否与糖尿病患者视网膜血流相关，仍是一个尚未解决的知识空白。本研究旨在利用OCTA评估无临床DR的T2DM患者血清维生素D水平与黄斑微血管参数之间的关系。
方法
研究设计与监督
本研究为横断面观察性研究，纳入了83例无DR的T2DM患者（83只眼）。根据维生素D水平将患者分为三组：A组（维生素D缺乏，VDD；血清维生素D < 20 ng/mL，n=26）、B组（维生素D不足；20 ng/mL ≤ 血清维生素D < 30 ng/mL，n=30）和C组（维生素D正常；血清维生素D ≥ 30 ng/mL，n=27）。使用Stata 13.1计算样本量以确保足够的检验效能。所有患者均符合T2DM诊断标准（HbA1c > 6.5% 且空腹血糖 > 7 mmol/L），并通过超广角彩色眼底照相检查确认无DR证据。研究方案经温州医科大学附属第二医院伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书，研究遵循《赫尔辛基宣言》原则。
患者招募
纳入标准为无DR的T2DM患者。排除标准包括：（1）其他视网膜疾病；（2）眼内手术或眼外伤史；（3）慢性或复发性葡萄膜炎或慢性开角型或闭角型青光眼；（4）可能影响图像质量的因素，如介质混浊、眼球震颤或固视不良/配合差；（5）未控制的系统性高血压；（6）酮症酸中毒；（7）慢性肾脏病、活动性感染、传染性肝病、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进或血清肌酐水平 > 176.8 mg/dL；（8）当前使用维生素D或钙补充剂以及影响维生素D代谢的药物；（9）过去一年内有骨折或骨科手术史或垂体腺瘤手术史。
眼科检查
通过临床检查和实验室分析确诊糖尿病。由同一位眼科医生进行基线眼科检查，该医生不知晓患者的血清维生素D水平、糖化血红蛋白等相关信息。收集的数据包括年龄、体重指数（BMI）、性别、糖尿病病程、HbA1c水平和血清25(OH)D水平（通过电化学发光法评估）。
OCTA检查使用VG100N SS-OCTA系统进行，扫描速度为每秒100,000次A扫描，以中心凹为中心进行6 × 6 mm扫描。信号强度指数高于8的图像被纳入分析。黄斑区被自动划分为中心凹区（0–1 mm）、旁中心凹区（1–3 mm）、中心凹周围区（3–6 mm）和四个象限（颞侧、鼻侧、上方、下方）。所有患者均使用托吡卡胺进行药物散瞳后，由同一台OCTA仪器相同模式扫描，重复三次。OCTA图像由经验丰富的视网膜专家审阅，排除分段错误或低质量图像。根据设备光学设计，放大校正公式由Bennett公式优化。眼底测量的放大率公式为：放大率 = 0.0492 × 眼轴长度（AL）– 0.1818，默认AL为24 mm时对应放大率为1。 resultant数据经AL校正后由集成软件自动计算。统计值为三次重复测量的平均值。
测量参数包括视网膜全层（FL）和浅层毛细血管丛（SCP）的PD。同时评估内视网膜层（IRL）FAZ相关参数，如周长、面积和非圆指数（AI）。所有OCTA检查由同一位眼科医生操作以保证一致性。
统计分析
使用IBM SPSS（版本27.0）进行统计分析。Kolmogorov-Smirnov检验用于评估数据正态性。正态分布数据采用单因素方差分析，非正态分布数据采用非参数Kruskal-Wallis检验。组间两两比较采用最小显著差异法，统计显著性设定为p < 0.05。分析比较了各组间的维生素D水平、年龄、BMI、糖尿病病程、HbA1c水平、眼轴长度和OCTA影像特征。性别分布差异采用卡方检验评估。维生素D与OCTA参数之间进行Pearson相关性分析。
结果
患者基本特征
各组间在年龄、BMI、糖尿病病程、HbA1c水平、眼轴长度方面均无统计学显著差异（p > 0.05）。A、B、C组的平均血清25(OH)D水平分别为15.8 ± 3.4 ng/mL、25.0 ± 2.8 ng/mL和36.8 ± 5.9 ng/mL，组间差异具有高度统计学意义（p < 0.001）。
浅层毛细血管丛（SCP）灌注密度（PD）比较
在SCP层面，维生素D缺乏（A组）患者的PD低于维生素D不足（B组）和正常（C组）患者。差异在颞侧和上方象限尤为显著。具体而言，在1-6 mm整体区域，A组PD（42.04 ± 3.8%）显著低于B组（44.94 ± 4.5%）和C组（47.24 ± 3.9%），p值分别为0.009和<0.001。在颞侧1-6 mm区域，A组PD（36.62 ± 5.7%）也显著低于B组（41.23 ± 5.2%）和C组（41.60 ± 4.3%），p值分别为0.001和<0.001。在中心凹周围区（3-6 mm），A组PD（40.93 ± 4.4%）显著低于B组（43.33 ± 4.8%）和C组（46.04 ± 4.2%），p值分别为0.048和<0.001。此外，在多个子区域，A组与B组、A组与C组之间的PD差异均达到统计学显著性，而B组与C组之间在许多区域无显著差异。
视网膜全层（FL）灌注密度（PD）比较
对视网膜FL 3–6 mm区域的分析显示，A组的PD显著低于B组和C组，尤其是在上方区域（p < 0.05）。例如，在3-6 mm整体区域，A组PD（32.94 ± 4.5%）显著低于B组（35.75 ± 4.2%，p=0.018）和C组（35.57 ± 4.4%，p=0.032）。然而，FL 1–3 mm区域的PD在各组间无显著差异（p > 0.05）。
黄斑无血管区（FAZ）参数比较
FAZ的面积、周长和AI在三组之间均未显示出统计学显著差异（p > 0.05）。
相关性分析
Pearson相关性分析显示，除1-3 mm区域的鼻侧和下方区域外，SCP的PD在所有其他区域与维生素D均呈弱正相关。FL的3-6 mm区域下方区域的PD与维生素D呈弱相关。FAZ面积与维生素D也呈弱相关。
讨论
DR是一种重要的糖尿病相关并发症，当其进展为严重的非增殖性糖尿病视网膜病变或增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）时，会大大增加视力丧失的风险。当前理论认为，T2DM通过氧化应激、免疫反应和慢性炎症等机制诱导视网膜PD降低，导致视网膜缺血和缺氧，进而引发血管内皮生长因子（VEGF）和其他血管生成因子上调，加速DR向PDR的进展。研究表明，VDD不仅有助于DR的发生，也是其进展的潜在因素。维生素D通过作用于视网膜内皮细胞（ECs）、周细胞（PCs）和血管平滑肌细胞中表达的维生素D受体（VDR），通过减少氧化应激、凋亡和炎症等机制，对DR的发生和进展发挥保护作用。研究显示，糖尿病小鼠视网膜PCs中的血管生成素-2（Ang2）通过p53信号通路触发PC凋亡。此外，据报道增加维生素D水平可降低肾脏和肺部Ang2的表达。因此，我们假设维生素D也可能降低视网膜VDR中Ang2的表达，从而保护 against PC凋亡。然而，需要进一步研究来验证这一假设。
先前关于VDD和视网膜血管密度的研究得出了不一致的结果。一项前瞻性研究报告，在VDD患者中，SCP、深层毛细血管丛（DCP）和FAZ的血管密度显著降低。然而，一项观察性病例对照研究发现，血清维生素D缺乏可导致血管密度增加，尤其是在DCPs中。这些 discrepant 结果可能归因于研究人群、研究设计和其他方法学因素的差异。然而，所有这些研究都是基于非糖尿病人群，迄今为止尚未有研究探讨维生素D与T2DM患者视网膜微血管之间的关联。
本研究使用6 × 6 mm OCTA扫描，定量分析了维生素D水平对无DR的T2DM患者黄斑微血管结构的影响，包括视网膜FL和SCP的PD，以及FAZ相关参数（面积、周长和AI）。
我们的研究结果表明，A组SCP在所有区域的PD均显著低于B组和C组，表明VDD与黄斑血管密度显著降低相关。这可能源于维生素D对视网膜微血管保护作用的减弱。视网膜微血管主要由ECs和PCs组成，两者都参与血管收缩。研究表明，VDR在PCs中的表达显著高于ECs，高血糖诱导的PC凋亡可导致毛细血管稳态破坏，进一步影响EC存活并导致毛细血管关闭，从而降低视网膜微血管密度。
我们的研究揭示了B组和C组之间PD存在统计学显著差异，尤其是在中心凹周围区（3–6 mm），表明VDD也与视网膜血管灌注密度降低相关。相关性分析结果显示维生素D与中心凹周围区PD呈正相关。这一发现与Castillo-Otí等人的研究结果相符，他们报告较低的血清25(OH)D水平与T2DM患者DR发生和进展风险较高相关。
我们的研究发现，在三个子区域中，颞侧区域的PD在A组显著低于B组和C组，且VDD患者SCP的PD降低在颞侧区域尤为明显。这表明VDD患者颞侧区域更容易发生缺血。此外，本研究中，A组中心凹周围区（3–6 mm）的PD显著低于其他两组，提示VDD患者的微血管变化可能最初发生在该区域。这表明视网膜血流变化可能对中心凹周围-颞侧区域最为敏感，这一发现与Alam等人的研究一致，他们确定中心凹周围-颞侧区域是早期检测DR最敏感的区域。
FAZ的结构变化主要由面积和周长增加所表征，这是由中心凹毛细血管丢失引起的。在本研究中，尽管观察到随着维生素D水平降低，三组中FAZ结构有变化和AI略有下降趋势，导致FAZ形状趋向不规则，但这些参数在组间未发现显著差异。FAZ大小因人而异，并受年龄、性别、中心凹厚度和眼轴长度等多种因素影响。此外，不同设备的测量数据差异以及不同边界分割方法导致的误差也会影响FAZ大小的估计。然而，一些研究表明FAZ大小的变化可以作为视网膜微血管缺血的指标。因此，比较FAZ大小时应考虑这些因素，FAZ可能不适合作为DR的早期筛查指标。
至于AI，先前的研究表明它可能比FAZ大小更能代表微血管变化，使其可能有助于早期筛查。AI反映了FAZ形状的不规则性，是毛细血管丢失和黄斑缺血的指标。然而，我们的研究显示三组间的AI无统计学显著差异。这表明AI可能不是VDD引起的微血管变化的敏感指标。不过，需要更大样本量的进一步研究来证实这一结论。
在本研究中，我们使用了SS-OCTA，其具有扫描速度更快、扫描面积更大的优点。凭借其更长的波长和更高的灵敏度，SS-OCTA增强了透过视网膜色素上皮（RPE）的穿透力，从而能够更好地检测深层血流信号。许多先前的DR研究侧重于3 × 3 mm OCTA图像。与OCTA相比，SS-OCTA能够在单次采集中扫描更大区域，例如后极部以外。根据de Carlo等人的研究，具有更大视野的6 × 6 mm扫描模式在检测与DR相关的视网膜血流变化方面比3 × 3 mm扫描模式更有效。广角成像可能有助于评估DR患者的视网膜血管系统。然而，这种模式需要更高的患者配合度，并且分辨率低于其他两种模式。
先前的研究表明，DCP对高血糖的反应更早、更明显。然而，由于浅层血流或屈光介质的噪声和伪影可能会影响深层血流的检测，本研究未调查更深的视网膜血管。相反，分析仅限于特定的视网膜区域，这可能不能完全代表视网膜血流的变化。未来需要更大样本量和对更深视网膜层进行OCTA成像的研究，以更全面地了解糖尿病患者维生素D与视网膜血流和灌注之间的关系。
我们队列中糖尿病患者血清25-羟基维生素D水平的观察到的变异性可能是多因素的。几个因素，其中许多在该人群中非常普遍，可能导致了这种异质性：日照差异、肥胖程度、饮食和补充剂摄入、糖尿病肾病以及遗传因素。我们承认这些因素，特别是肥胖、饮食习惯和肾病的存在/严重程度，也可能是独立的混杂变量，直接影响视网膜微血管和OCTA指标。尽管本研究控制了一些潜在变量，如年龄、BMI和HbA1c，但仍然存在一种可能性，即我们观察到的关联并非仅由维生素D本身驱动，而可能由糖尿病这些其他病理生理因素介导或混淆。需要具有纵向设计和更全面协变量调整的未来研究来区分维生素D的具体作用与其他密切相关的代谢和生活方式因素。
本研究有几个局限性在解释结果时应予以考虑。首先，横断面研究设计的性质无法确定所检查变量之间的因果关系。其次，研究结果基于相对较小的样本量，可能限制了检测显著关联的统计效能。第三，研究缺乏对DCP的直接评估，否则可以提供更全面的分析。此外，潜在的混杂因素，如饮食摄入、日照和体力活动，未完全控制，可能影响了结果。另一个局限性是依赖于血清维生素D水平的单次测量。虽然这提供了维生素D状态的快照，但可能不能完全代表长期或历史暴露，而后者可能与慢性视网膜微血管变化的发展更相关。最后，研究人群的具体特征可能限制了我们研究结果对其他更广泛或不同人群的普适性。
结论
本研究证实，在无临床DR的2型糖尿病患者中，较低的血清维生素D水平与黄斑区灌注密度（PD）降低相关，尤其是在中心凹周围-颞侧区域。维生素D缺乏可能通过影响视网膜微循环参与糖尿病视网膜病变的早期病理过程。未来需要进行纵向研究，并随时间重复测量维生素D水平，以更准确地确定持续维生素D状态与糖尿病视网膜微血管病变进展之间的关系。
