基于直接PCR的TPO基因内含子10 VNTR分析：一种快速检测产前诊断中母源细胞污染的新方法

《Clinical and Translational Science》：Direct PCR-Based VNTR Analysis of TPO Intron 10 for Rapid Detection of Maternal Cell Contamination in Prenatal Diagnosis

本研究开发并验证了一种无需DNA提取的直接PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）分析方法，用于快速、准确地检测产前诊断样本中的母源细胞污染（MCC）。该方法针对甲状腺过氧化物酶（TPO）基因内含子10区域，利用高pH缓冲液直接对全血和羊水细胞沉淀进行PCR扩增，在90个重症地中海贫血风险家庭的样本中显示出与标准DNA-PCR方法100%的一致性。该技术显著简化了工作流程，降低了资源消耗，为资源有限实验室进行可靠的MCC筛查提供了实用工具，从而保障产前遗传学诊断的准确性。

引言

产前诊断是检测和预防遗传性疾病的关键手段。在胎儿组织样本（如羊水）的采集和处理过程中，存在母源细胞污染（Maternal Cell Contamination, MCC）的风险，这可能导致严重的误诊。例如，将母源细胞误判为胎儿细胞，可能使健康胎儿被误诊为患病，或使患病胎儿被误判为携带者。尽管MCC危害重大，但在许多标准实验室中，对羊水样本进行常规MCC筛查并未普及。VNTR分析是检测MCC的有效方法，其中甲状腺过氧化物酶（TPO）基因内含子10区域的VNTR具有高度多态性。然而，传统的VNTR分析需要先进行DNA提取，步骤繁琐，限制了其在资源有限实验室的应用。直接PCR技术能够绕过DNA提取步骤，直接将样本加入PCR反应体系，大大简化了流程。本研究旨在开发和验证一种用于TPO基因内含子10 VNTR分析的直接PCR方法，以实现对产前诊断样本中MCC的快速、可靠检测。

方法

本研究纳入了2024年1月至4月期间收集的90个家庭的样本，包括73份父亲全血、90份母亲全血和90份胎儿羊水样本。通过离心制备羊水细胞沉淀和白细胞沉淀。直接PCR反应体系采用特殊的高pH缓冲液以克服样本中的PCR抑制物，并使用针对TPO内含子10 VNTR区域的特异性引物（G186和G187）进行扩增。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。将直接PCR的结果与标准的基于DNA提取的VNTR分析结果进行盲法比较以验证其准确性。同时，在148名无关泰国个体中评估了TPO内含子10 VNTR的杂合率，以衡量该标记物的多态性。数据分析采用描述性统计和一致性评估。

结果

在90个家庭中，直接PCR-VNTR分析结果显示，72.2%（65/90）的家庭获得了信息性的VNTR分型结果，其中71.1%（64/90）的家庭排除了MCC，1.1%（1/90）的家庭检测到MCC。另有27.8%（25/90）的家庭因母源VNTR为纯合型或父母与胎儿VNTR模式相似而无法判断MCC。直接PCR与标准DNA-PCR方法在所有90个家庭中的结果完全一致（一致性100%）。对148名无关泰国个体的分析显示，TPO内含子10 VNTR的杂合率高达87.8%，表明该标记在泰国人群中具有很高的多态性，非常适合用于MCC筛查。研究还通过一个代表性家庭案例（父亲为Hb E纯合子，母亲为β^CD41/42突变携带者）展示了该直接PCR方法在Hb E/β⁰-地中海贫血产前诊断中的应用价值，在准确诊断胎儿为Hb E/β⁰-地中海贫血患者（基因型为β^CD41/42/β^E）的同时，通过VNTR分析确认了样本中无MCC，保证了诊断的可靠性。

讨论

本研究成功建立并验证了一种用于TPO基因内含子10 VNTR分析的直接PCR方法。该方法省去了DNA提取步骤，利用高pH缓冲液有效克服了全血和羊水样本中常见的PCR抑制物，实现了快速、可靠的MCC检测。与需要复杂设备和多重位点试剂盒的短串联重复序列（STR）分析相比，VNTR分析结合琼脂糖凝胶电泳的方案更经济、简便，尤其适合资源有限的实验室。本研究发现TPO内含子10 VNTR在泰国人群中的杂合率（87.8%）高于既往报道，进一步支持了其作为MCC筛查标记的适用性。尽管该方法未能达到100%的信息率（因母源纯合或父母子模式相似），但其72.2%的信息率已相当高。将MCC检测纳入产前诊断流程，可以作为双重质控措施，提高诊断准确性，辅助临床医生做出更可靠的决策。该直接PCR技术的应用有望简化实验室工作流程，降低成本和周转时间，促进MCC筛查在更广泛 settings，特别是在资源有限地区的推广应用，从而提升产前遗传学诊断的整体质量。未来研究可探索将此法应用于其他VNTR多态性或样本类型，并评估其自动化潜力。