《Molecular Ecology Resources》：Residual eDNA in eRNA Extracts Skews eRNA-Based Biodiversity Assessment: Call for Optimised DNase Treatment
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这篇综述通过对比DNase处理与未处理的eRNA样本，系统评估了环境RNA（eRNA）宏条形码技术中残留环境DNA（eDNA）对生物多样性评估造成的严重影响。研究揭示，未经DNase处理的样本会显著夸大物种丰富度（平均每站点多检出>25%的类群），并扭曲群落组成，导致大量假阳性检出（如淡水河流中检出海洋类群）。文章强调，优化DNase处理方案（包括酶浓度、孵育时间与处理次数）对标准化eRNA工作流程、提升生态监测准确性至关重要。
引言
环境核酸（eNA）技术，包括环境DNA（eDNA）和环境RNA（eRNA），已成为生态与环境学科中变革性的工具。eDNA可持久存在于环境中，反映当前和历史生物存在，而eRNA由于其快速降解特性，能更精确地捕捉代谢活跃的生物体，从而提供生物活动的实时快照。尽管eRNA宏条形码技术在提高生物多样性评估的时间分辨率方面展现出巨大潜力，但其方法学误差，特别是eRNA提取物中残留eDNA导致的假阳性问题，仍未得到充分表征和解决。本研究旨在量化残留eDNA对eRNA生物多样性评估的影响。
材料与方法
研究采用接收污水处理厂（WWTP）出水的淡水河流作为模型系统。在该系统中，处理后的出水含有eDNA但eRNA含量极低或无法检测，为评估eDNA残留影响提供了理想场景。在四个采样点（WWTP排放口上游S1、S2，排放口S3，下游S4）采集水样，提取总eRNA后均分为两份，一份进行DNase处理，另一份不处理。通过鱼类特异性引物扩增线粒体12S rRNA区域，进行高通量测序和生物信息学分析，比较两组样本在物种丰富度、群落组成和类群相对丰度等方面的差异。
结果
生物多样性比较
DNase处理与未处理eRNA样本的比较显示，未处理样本一致性地高估了鱼类生物多样性。在所有四个采样点，未处理样本检测到的类群数量均显著高于DNase处理样本（图2A）。尤其在WWTP排放口（S3点），差异最为显著，未处理样本平均检出48.5个类群，而处理样本仅为36.7个。对海洋鱼类的分析进一步支持了eDNA残留的影响，未处理样本中检出了大量生态学上不可能存在于淡水环境的海洋类群（图2B）。
残留eDNA对类群检测的影响
Venn网络图分析显示，未处理组特有的类群数量显著多于处理组（图3A）。跨所有站点，未处理样本额外检出了29个类群，其中16个为海洋鱼类，13个为淡水鱼类，包括一些观赏鱼种（图3B）。这些额外检出的类群，尤其是那些检测频率高、相对丰度较高或生态学上不合理的类群，强烈表明其来源于残留eDNA污染。
不同丰度水平的类群检测
按相对丰度将类群分为高（≥1%）、中（0.1%-1%）、低（≤0.1%）三档。在受WWTP出水影响较大的S3和S4点，海洋物种不再局限于低丰度类别。未处理样本中检出了高、中丰度的海洋类群，而这些类群在处理样本中丰度降低或完全未被检出（图4），表明残留eDNA会导致即使在中等至高丰度水平也会出现假阳性。
群落组成差异
非度量多维尺度分析（NMDS）显示，DNase处理组和未处理组的群落组成存在明显且一致的分离（图5）。置换多因素方差分析（PERMANOVA）证实了这种差异的统计学显著性。对未处理组中相对丰度升高的类群进行折叠变化分析发现，某些类群的丰度增加了10倍以上，特别是在S3点（图6），表明残留eDNA严重扭曲了基于eRNA的丰度估计。
讨论
eRNA提取物中eDNA残留的普遍性
即使采用RNA特异性提取方案，复杂环境样本中的细胞外DNA片段也常常无法被完全清除，导致eDNA残留在最终的eRNA制备物中。本研究结果证实，这种残留是eRNA生物多样性评估中一个常见且影响重大的误差来源。
区分残留eDNA来源类群的技术挑战
由于宏条形码技术的极高灵敏度，以及随机抽样误差的存在，仅依靠生物学重复或逆转录阴性对照（RT-minus control）难以可靠地区分来源于稀有eRNA转录本的真实信号和残留eDNA造成的污染。本研究利用WWTP出水富含eDNA而eRNA缺失的特性，为评估残留eDNA的影响提供了严谨的现场模型。
残留eDNA对eRNA研究的影响
残留eDNA不仅导致物种丰富度高估，还会显著扭曲群落组成指标，如相对丰度，这可能影响对生态系统健康状况的评估、环境-群落相互作用的推断以及多元统计分析结果。
优化eRNA工作流程中的DNase处理
尽管使用了过量的DNase，研究中仍检测到少量海洋物种，这可能源于单步DNase处理未能完全去除eDNA，和/或商业鱼类残留组织中存在真实的eRNA。因此，有必要进一步评估DNase处理参数（如酶浓度、孵育时间、消化循环次数），并在不同环境基质中验证，以建立能在彻底去除DNA的同时保持RNA完整性的标准化流程。建议使用RNA spike-in和mock community等工具来监控DNA去除效率和RNA完整性。
结论
本研究明确证明，eRNA提取物中的残留eDNA会导致基于eRNA的生物多样性评估出现物种丰富度的显著高估和群落组成的严重扭曲。在eDNA浓度较高的地点（如污水处理厂排放口），假阳性检测的风险更高。因此，eRNA工作流程必须包含DNase处理步骤，并通过灵敏的qPCR验证其效率。此建议同样适用于土壤、沉积物和空气等其他环境基质的研究，但需根据基质的特异性优化处理方案。
