基于环境适应性的苹果采后病害生防菌筛选与生态生理特性研究

《Postharvest Biology and Technology》：Biocontrol and ecophysiological characterization of bacterial and yeast BCA candidates isolated from two different environments to control postharvest diseases

本研究针对化学杀菌剂在采后病害防控中的局限性，从两种不同生态环境（埃布罗河谷与比利牛斯山脉）的苹果果实中分离筛选具有生防潜力的微生物。通过对213株候选菌株（包括细菌、酵母和丝状真菌）的体内外评价，发现4株细菌和25株酵母对苹果主要采后病原菌（扩展青霉、灰葡萄孢和匍枝根霉）具有显著抑制效果（病害发生率降低>75%）。进一步对两株聚团泛菌和两株肉色维斯尼亚克酵母进行生态生理学表征，发现其生长特性与来源地环境适应性显著相关。研究为开发适应特定环境条件的靶向生防制剂提供了理论依据，对推动苹果采后病害的绿色防控具有重要意义。

　　

每年，因植物病害导致的全球农作物损失高达400亿美元，其中采后病害造成的损失尤为突出。苹果作为全球第四大消费水果，在采后贮藏期间极易受到扩展青霉（Penicillium expansum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）等病原真菌的侵染，造成严重的经济损失。长期以来，化学杀菌剂是防治采后病害的主要手段，但欧盟指令2009/128/CE的实施加强了对化学农药使用的限制，推动了对环境友好型替代方案的迫切需求。生物防治剂（BCA）作为一种可持续的替代策略，显示出广阔的应用前景。然而，现有商业生防制剂在市场上面临着田间稳定性不足、注册流程漫长等多重挑战。

为了解决这些问题，研究人员开展了一项创新性研究，旨在从苹果微生物组中筛选具有高效生防潜力的菌株，并评估其环境适应性。该研究近期发表在《Postharvest Biology and Technology》期刊上。研究人员采用培养组学（Culturomics）方法，从西班牙加泰罗尼亚地区两个对比鲜明的环境——气候温暖干燥的埃布罗河谷（Ebro Valley）和寒冷多雨的比利牛斯山脉（Pyrenees Mountains）的苹果果实中，分离获得了957株微生物（包括510株细菌、231株酵母和216株丝状真菌）。通过针对性地筛选已知具有生防潜力的属，研究人员从213株潜在生防菌中，鉴定出29株（4株细菌和25株酵母）能有效抑制三种主要采后病原菌，使病害发生率降低超过75%。

为探究环境适应性对生防效果的影响，研究人员重点选取了分别来源于山区和河谷的两株聚团泛菌（Pantoea agglomerans，菌株B109和B296）以及两株肉色维斯尼亚克酵母（Vishniacozyma carnescens，菌株L157和L111）进行深入研究。关键技术方法包括：利用体外培养评估候选菌株在不同温度（0、4、10、25、30、36°C）和水活性（a_w，0.94至0.998）条件下的生长曲线（采用修正的Gompertz模型拟合）；通过体内实验在“Golden Reinders”苹果伤口上接种生防菌和病原菌，评估其对病害的抑制效果（发病率和严重度）；并在苹果果实表面模拟不同相对湿度条件（40%和85% RH），监测生防菌的种群动态变化。

3.1. 潜在生防菌的体内筛选

研究首先对分离自苹果果际（carposphere）的微生物库进行筛选。结果表明，在测试的124株细菌、78株酵母和11株丝状真菌中，分别有17株细菌和39株酵母对扩展青霉表现出超过75%的病害控制效果。进一步对抗所有三种病原菌的菌株进行筛选，最终选定两株聚团泛菌（分别命名为BM和BV）和两株肉色维斯尼亚克酵母（分别命名为YM和YV）进行后续深入研究。这些菌株均能显著降低三种病原菌引起的病害发生率和严重度。

3.2. 四种候选菌的体外生态生理学表征

研究人员在体外系统评估了这四种候选菌在不同温度和水活性条件下的生长情况。对于细菌候选菌（BM和BV），水活性是限制其生长的主要因素。在最低水活性（0.94 a_w）下，来源于山区的BM菌株在所有测试温度下均无法生长，而来源于河谷的BV菌株在大部分温度下（除0-10°C外）仍能生长。在较高水活性（0.98和0.998 a_w）和较低温度（0-10°C）下，BM菌株表现出比BV菌株更高或相似的生长速率和最大生长量，表明其对寒冷环境更好的适应性。在25°C（最适温度）及更高温度（30°C和36°C）下，BV菌株的生长普遍优于BM菌株。对于酵母候选菌（YM和YV），在低温条件下（0°C和4°C），YM菌株在所有水活性下的延滞期均短于或类似于YV菌株，且在低水活性条件下（0.94和0.96 a_w）生长更为显著。然而，在较高温度下（10°C、25°C和30°C），YV菌株表现出更短的延滞期、更高的生长速率和吸光度值。在36°C时，两种酵母均无法生长。

3.3. 选定生态生理条件下的生长曲线

在最优条件下（25°C，充分通气），细菌候选菌在18小时达到最大生长量（BV: 1.55 × 10⁹CFU mL^-1; BM: 2.17 × 10⁹CFU mL^-1），而酵母候选菌在48小时达到最大生长量（YV: 6.28 × 10⁸CFU mL^-1; YM: 6.73 × 10⁸CFU mL^-1）。在不同水活性条件下，细菌BV菌株在低水活性（0.94 a_w）下仍能缓慢生长，而BM菌株则不能。酵母菌株在所有测试水活性下均能生长，且在48小时达到最大生长量，两种菌株间无显著差异。

3.4. 不同相对湿度下候选菌的动态变化

研究人员进一步评估了候选菌在苹果果实表面在不同相对湿度（40%和85% RH）下的存活情况。结果表明，酵母菌的存活能力显著优于细菌。培养12天后，酵母菌在40%和85% RH下的种群数量下降幅度较小（YM和YV的log减少值分别为0.59/0.41和1.18/0.71），而细菌的下降幅度较大（BV和BM的log减少值分别为1.79/2.51和2.68/2.56）。总体而言，所有测试菌株在40% RH下的表现优于85% RH。细菌种群在接种后24小时内即出现显著下降（约1 log CFU cm^-2），随后缓慢下降。酵母种群则相对稳定，在整个实验期间保持较高水平。

本研究通过综合运用体内外实验，成功从苹果微生物组中筛选出对主要采后病原菌具有高效抑制活性的生防候选菌株，并深入揭示了其生长特性与来源地环境条件之间的适应性关联。研究表明，来源于河谷地区的细菌菌株（BV）对低水活性和高温的耐受性更强，而来源于山区的酵母菌株（YM）则更适应低温和一定程度的干燥胁迫。这种环境适应性很可能是其在自然生境中长期进化的结果。研究结果强调，在筛选和开发新的生防菌株时，充分考虑其环境适应性至关重要。选择来源于特定环境、已预先适应目标应用条件的菌株，有望提高生防制剂在田间复杂环境下的稳定性和防治效果。该研究不仅为开发针对苹果采后病害的新型高效生防产品提供了宝贵的菌种资源，也为基于微生物生态学原理设计更具韧性的生物防治策略提供了新的思路。未来，将具有互补环境适应性的菌株（如BV和YM）构建成微生物群落（ synthetic microbial community），可能进一步提高生防效果在不同环境条件下的稳定性和广谱性。