《Poultry Science》：The construction of recombinant DNA vaccine pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ and its immune enhancement effect against
Eimeria tenella
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本研究针对严重危害养禽业的鸡球虫病，构建了融合鸡源细胞因子chIL-2和chIFN-γ的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体蛋白27(EtROP27)重组DNA疫苗pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ。结果表明，该疫苗能在体内有效表达，显著诱导细胞和体液免疫应答，降低卵囊排出量，减轻盲肠病变，提高增重，抗球虫指数(ACI)达183.51，显示出优异的免疫保护效果，为开发新型球虫DNA疫苗提供了新策略。
在全球家禽养殖业中，有一种微小但破坏力极强的寄生虫——柔嫩艾美美耳球虫(Eimeria tenella)，它引起的鸡球虫病每年导致高达140亿美元的经济损失。这种寄生虫专门攻击鸡的盲肠上皮细胞，引起出血性盲肠炎，发病率高达38.7%，死亡率可超过70%，堪称养禽业的“隐形杀手”。
目前，养殖场主要依靠抗球虫药物来控制疫情，但长期使用导致耐药性问题日益严重，药物残留更是威胁食品安全。虽然活疫苗有一定保护效果，但生产成本高、免疫效果不稳定，且存在毒力返强风险。科学家们一直在寻找更安全有效的解决方案，DNA疫苗技术为此带来了新希望。
在这项发表于《Poultry Science》的研究中，山西农业大学的科研团队将目光投向了柔嫩艾美耳球虫的棒状体蛋白27(EtROP27)。这种蛋白在寄生虫入侵宿主细胞的过程中扮演关键角色，具有很强的免疫原性。更有趣的是，研究人员创造性地将两种鸡源细胞因子——白细胞介素-2(chIL-2)和γ干扰素(chIFN-γ)与EtROP27抗原基因融合，构建了一种新型重组DNA疫苗，探索其能否产生“1+1>2”的免疫增强效果。
关键技术方法
研究使用SPF鸡为模型，通过分子克隆技术构建了四种DNA疫苗载体，采用肌肉注射方式进行免疫。通过RT-PCR和Western blot验证疫苗体内表达，通过攻毒实验评估保护效果，使用ELISA检测血清细胞因子和抗体水平，采用qPCR分析炎症因子mRNA表达，并利用免疫组化技术观察脾脏T、B淋巴细胞活化情况。
DNA疫苗的成功构建
研究人员成功将EtROP27基因克隆至pVAX1.0真核表达载体，分别插入chIL-2和/或chIFN-γ基因，构建了单基因疫苗pVAX-ROP27、双基因疫苗pVAX-ROP27-IL-2和pVAX-ROP27-IFN-γ，以及三基因疫苗pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ。经PCR、酶切和测序验证，所有重组质粒构建正确。
DNA疫苗可在体内表达
RT-PCR和Western blot结果证实，所有DNA疫苗均能在鸡肌肉组织中有效转录和表达相应的目的蛋白。pVAX-ROP27组表达约38 kDa的ROP27蛋白，pVAX-ROP27-IL-2组表达约54 kDa的融合蛋白，pVAX-ROP27-IFN-γ组表达约57 kDa的融合蛋白，而pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ组则表达约75 kDa的三者融合蛋白。
DNA疫苗的免疫保护效果
攻毒实验结果显示，所有DNA疫苗均能有效保护鸡只抵抗柔嫩艾美耳球虫感染。与攻毒对照组相比，免疫组鸡只体重增加显著，卵囊排出量大幅减少，盲肠病变明显减轻。特别值得注意的是，pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ组效果最佳，抗球虫指数(ACI)达到183.51，属于高效抗球虫效果。该组卵囊减少率达80%，盲肠病变评分最低。
盲肠损伤的减轻
组织病理学观察显示，攻毒对照组盲肠组织严重受损，上皮细胞坏死脱落，腺体破裂，大量炎细胞浸润。而pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ组盲肠结构保持完整，仅见轻微病变，寄生虫各发育阶段数量显著减少，表明该疫苗能有效减轻感染引起的组织损伤。
抗体和细胞因子反应
ELISA检测发现，所有疫苗均能诱导血清IL-2、IFN-γ、IgY和IgA水平升高，其中pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ组这些免疫指标水平最高。这表明细胞因子和抗体的协同作用增强了疫苗的免疫保护效果。
炎症细胞因子mRNA表达
qPCR分析显示，疫苗免疫组鸡只盲肠组织中炎症细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著低于攻毒对照组，但高于非攻毒对照组。而IL-4 mRNA表达在各组间无显著差异，表明疫苗主要诱导Th1型免疫应答，且不会引起过度炎症反应。
T、B淋巴细胞活化和增殖的动态变化
免疫组化分析证实，所有DNA疫苗均能促进脾脏T、B淋巴细胞的活化增殖。含有chIL-2基因的疫苗诱导了更强的T细胞活化反应，而pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ组对T、B细胞的活化效果最为显著，表明chIL-2和chIFN-γ在增强细胞免疫应答中具有协同作用。
研究结论与意义
本研究成功构建了含有chIL-2和chIFN-γ基因的柔嫩艾美耳球虫EtROP27 DNA疫苗，并证实其在SPF鸡模型中能诱导强烈的细胞和体液免疫应答，提供良好的抗球虫保护。特别是pVAX-ROP27-IL-2-IFN-γ双细胞因子疫苗显示出最优的免疫保护效果，抗球虫指数达到183.51。
该研究的创新之处在于将两种具有免疫增强作用的细胞因子chIL-2和chIFN-γ与主要抗原EtROP27进行基因融合，而非简单的混合使用，从而在抗原呈递过程中实现细胞因子的局部高效表达，更有效地调节免疫应答方向。chIL-2作为T细胞生长因子，有效促进T淋巴细胞活化增殖；而chIFN-γ则激活巨噬细胞，增强其抗寄生虫能力，两者协同作用显著提升了疫苗的保护效力。
这项研究不仅为鸡球虫病的防控提供了一种有前景的候选疫苗，也为其他寄生虫病DNA疫苗的设计提供了新思路。通过基因融合技术将抗原与免疫调节因子结合，可能是提高DNA疫苗效力的有效策略。然而，研究人员也指出，要将该疫苗推向实际应用，还需进行剂量优化、长期保护性评价、野外试验等进一步研究。此外，评估该疫苗对其他艾美耳球虫物种(如巨型艾美耳球虫)的交叉保护作用，对于开发广谱抗球虫疫苗具有重要意义。
总体而言，这项研究为开发新一代抗球虫DNA疫苗奠定了坚实基础，为解决养殖业面临的球虫病防控难题提供了有希望的新方案。随着进一步优化和完善，这种基于免疫增强策略的DNA疫苗有望在未来养禽业中发挥重要作用。
