《Poultry Science》：Single-Cell Transcriptomics Reveals Diversity and Conservation of Chicken Lymphocytes
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本研究通过构建鸡三个主要免疫器官（胸腺、法氏囊和脾脏）的高分辨率单细胞转录组图谱，系统鉴定了24种免疫与基质细胞类型，解析了其器官特异性分布、发育轨迹及关键转录因子调控网络，揭示了B细胞和T细胞在不同分化阶段的潜在性二态性基因表达，并通过跨物种比较证实了核心免疫调节回路（如MEF2C、LEF1、GATA3等转录因子）在鸟类与哺乳动物间的显著保守性，为理解禽类免疫防御机制、推进抗病育种及脊椎动物免疫进化研究提供了重要资源。
鸡作为重要的农业物种和免疫学模型动物，其免疫功能的强弱直接关系到对禽流感、新城疫等重大传染病的抵抗力，并对禽业发展至关重要。然而，与传统研究较为深入的人类和小鼠免疫系统相比，科学界对鸡免疫系统的认知仍存在一个关键空白：缺乏一个整合多个免疫器官的系统性单细胞图谱。以往的研究多集中于单个组织内的特定免疫细胞类型，无法从全局视角揭示免疫细胞亚型的异质性、重建免疫应答过程中的动态调控过程，更难以阐明不同组织间免疫细胞谱系发育和成熟轨迹以及其核心且保守的转录调控因子。这些局限性严重阻碍了人们对禽类免疫防御机制的深入理解，也制约了针对禽类疾病抗性育种的发展。
为了填补这一空白，湖南农业大学的研究团队在《Poultry Science》上发表了一项开创性研究。研究人员收集了90日龄黄羽鸡的胸腺、法氏囊和脾脏这三个主要免疫器官，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，成功构建了包含72,627个高质量细胞的禽类免疫系统高清全景图谱。他们的分析精准识别出24种不同的细胞类型，并精细描绘了它们在器官中的特异性分布：B细胞主要富集于法氏囊，而T细胞亚群则富集于胸腺，脾脏作为次级淋巴器官则呈现出混合细胞群体。研究进一步勾勒了淋巴细胞的发展轨迹，并识别出谱系定向过程中的关键转录因子，例如TCF12之于CD4+CD8+T细胞，SOX13和GATA3之于T辅助2（Th2）细胞。尤为引人注目的是，研究揭示了潜在的性二态免疫成熟模式：B细胞的性别偏好基因表达主要出现在早期分化阶段，而T细胞的差异在增殖期最为显著。跨物种比较分析则展示了核心免疫调节回路在进化上的惊人保守性，MEF2C、LEF1、GATA3等转录因子在禽类和哺乳动物免疫中扮演着保守的角色。这项资源为理解禽类免疫防御、推进家禽抗病育种提供了基础框架，并为脊椎动物免疫学提供了进化视角的见解。
本研究主要采用了以下关键技术方法：从三只90日龄黄羽鸡（两雌一雄）获取胸腺、法氏囊和脾脏组织样本，经酶消化制备单细胞悬液；使用10X Genomics平台进行单细胞RNA测序文库构建，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序；利用CellRanger和Seurat软件包进行数据质控、比对、整合与细胞聚类分析；通过CellMarker数据库和文献报道的标记基因对24个细胞簇进行注释；应用pySCENIC分析转录因子调控网络，CellChat推断细胞间通讯，Monocle3构建细胞发育轨迹；采用edgeR、MAST和Seurat的FindMarkers功能鉴定性别差异表达基因（sex-DEGs）；从公共数据库获取人胸腺scRNA-seq数据（E-MTAB-8581），与鸡数据集进行整合与比较分析。
景观图：鸡主要免疫器官的单细胞图谱
研究人员对来自鸡胸腺、脾脏和法氏囊的细胞单细胞转录组数据进行了分析和整合。经过严格质控后，共保留72,627个细胞用于下游分析。通过无监督聚类，成功鉴定出24个转录谱不同的细胞簇，并将其归类为10个细胞类型组，包括B细胞、经典树突状细胞、上皮细胞、红细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、浆细胞、浆细胞样树突状细胞、血小板和T细胞。通过已知和新型标记基因对这24种细胞类型进行了精细定义，例如T细胞谱系表达了经典的泛T细胞标记物如CD3D、CD3E以及非经典调节因子BCL11B；B细胞谱系则高表达经典标记基因EBF1和PAX5。分析细胞类型在三个免疫器官中的组成揭示了其特化和富集模式，与已知的生理功能高度吻合。法氏囊中B细胞谱系占主导地位（91.24%），胸腺则以T细胞为主（83.16%），而脾脏作为次级淋巴器官则含有支持系统性免疫应答的混合细胞群体。细胞周期 phase 分析和性别差异表达基因（sDEGs）筛查进一步揭示了免疫景观的增殖动态和潜在的性二态性。
转录调控和鸡免疫细胞类型间的细胞间通讯网络
在构建了鸡免疫器官的细胞图谱基础上，研究人员着重分析了T和B淋巴细胞的亚型及其发育轨迹，以阐明免疫细胞如何分化为功能谱系。通过比较所有24个细胞群体中细胞类型特异性的转录调节子，识别出了与不同免疫谱系特异性相关的关键转录因子，例如CD4+CD8+T细胞中的TCF12，增殖性前B细胞中的E2F1，T辅助2细胞中的SOX13和GATA3等。相关性分析显示，功能相关或发育潜能相似的细胞共享相似的调控网络。基于单细胞数据推断的细胞间串扰分析构建了全面的细胞-细胞通讯图谱，揭示了不同免疫细胞类型内部和之间存在频繁而复杂的信号相互作用。增殖细胞类型（如前B细胞、增殖性B细胞、增殖性CD8+T细胞）通常是重要的信号发送者，而更终末分化或特化的细胞则主要作为信号接收者。BAFF和MK通路被鉴定为在B细胞组中特异性富集，而MIF通路则在T细胞组内主要活跃。
鸡淋巴细胞的异质性细胞亚型与发育细胞轨迹
为了阐明淋巴细胞特性和分化的分子机制，研究人员对来自胸腺的T细胞和来自法氏囊的B细胞进行了亚群聚类和轨迹分析。高分辨率分析在B细胞谱系内定义了6个不同的亚型，在T细胞谱系内定义了11个亚型。构建发育轨迹显示，B细胞发育从初始B细胞开始，最终分化为终末的MHC相关细胞；而T细胞发育则从CD4+和CD8+初始T细胞早期分支为两条主要路径：一条导向CD4+CD8+T细胞，另一条导向LYN+T细胞。随着伪时间进展，细胞类型比例的变化验证了这些轨迹，例如增殖性亚型（如VPREB3+B细胞）的比例随时间下降，而功能性、效应器样亚型（如MHC相关B细胞和CD4+CD8+T细胞）的比例增加。动态基因表达分析进一步阐明了潜在的分子程序。
B和T淋巴细胞中潜在的性别差异基因表达和通路
鉴于性别二态性在鸟类中受Z染色体基因转录差异的强烈影响，研究人员系统性地鉴定了B和T淋巴细胞中的性别差异表达基因（sDEGs）。比较分析发现，edgeR是灵敏度最高的方法。功能富集分析显示，B细胞中的sDEGs显著富集于内质网中的蛋白质加工、萜类骨架生物合成以及MAPK信号通路等通路；T细胞中的sDEGs则富集于剪接体、核糖体以及内质网中的蛋白质加工通路。尽管MAPK信号通路在B和T细胞的sDEGs中均有富集，但参与该通路的基因却不同。对sDEGs在B和T细胞亚型中分布的进一步调查显示，大多数sDEGs是特定于单个细胞类型的，但有一小部分sDEGs在几乎所有亚型中共享，这些基因主要位于Z染色体上。
鸡与人胸腺scRNAseq数据的跨物种分析
通过对鸡胸腺和一个公共人胸腺数据集进行整合比较分析，评估了淋巴细胞生物学的进化保守性。基于经典标记基因表达的人工注释识别出16种两个物种共有的、同源的 distinct 细胞类型。尽管细胞分类学保守，但这些细胞类型的相对丰度在物种间分布不均。人类胸腺富含增殖性T细胞、T辅助17（Th17）细胞和记忆T细胞，而鸡胸腺则含有显著更高比例的初始T细胞和CD4+CD8+双阳性T细胞。基因表达相关性量化显示，当使用前2000个高变基因时，物种内的细胞类型间相关性远高于跨物种同一细胞类型的相关性。然而，当分析扩展到所有同源基因时，几种关键的免疫细胞类型，包括巨噬细胞、增殖性细胞和CD8+T细胞，在鸡和人之间表现出显著的保守性。关键的转录调节因子的表达在进化上表现出显著的保守性。
本研究通过整合胸腺、法氏囊和脾脏这三个主要免疫器官的转录组数据，提供了鸡免疫系统的全面单细胞图谱。研究成功鉴定了24种不同的细胞类型，并系统性地表征了它们的分子特征、转录调控、发育轨迹和进化保守性。这项工作填补了禽类免疫学的关键空白，并为基础研究和农业应用提供了宝贵的见解。具体而言，本研究的多维分析桥接了禽类与哺乳动物免疫学，完善了当前关于脊椎动物免疫系统组织的原理，同时突出了影响家禽免疫功能的物种特异性适应。研究发现，尽管鸡与哺乳动物在核心免疫调节逻辑上存在深刻的保守性，但细胞类型比例、某些特定细胞群体（如MHC相关B细胞、LYN+T细胞）以及性别差异表达的模式都体现了禽类的特异性。这些发现不仅为推进抗病家禽育种提供了分子基础，而且巩固了鸡作为解码脊椎动物免疫进化基本原理的强大模型的作用。研究的局限性包括可能存在的细胞类型回收偏差、对同源基因和保守分子网络假设的依赖，以及探索性性别二态性分析样本量较小等，为未来研究指明了优化方向。
