铜结合伴侣蛋白PcuC中甲硫氨酸氧化敏感性的定量图谱研究

《Redox Biology》：Quantitative mapping of methionine sensitivity to oxidation in the copper-bound PcuC chaperone

本研究针对铜结合蛋白中甲硫氨酸（Met）氧化敏感性难以定量评估的难题，利用特异性氧氮杂环丙烷探针结合质谱技术，系统分析了铜伴侣蛋白PcuC在载铜与未载铜状态下各Met位点的氧化动力学。研究发现铜配位显著增强了结合位点Met63与Met88的氧化敏感性，并通过结构解析揭示其敏感性分别与溶剂可及性和局部正电荷分布相关。该工作为理解金属配位调控蛋白质氧化机制提供了新范式，发展的探针技术为（金属）蛋白质氧化敏感性图谱绘制提供了强大工具。

　　

在生命活动中，金属离子尤其是铜（Cu），扮演着不可或缺的角色。作为多种关键酶的辅因子，铜参与电子传递、氧化还原催化及金属稳态维持等重要生物学过程。然而，铜是一把双刃剑。在蛋白质中，铜通常由组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）等残基配位，这些残基本身对氧化应激尤为敏感。铜离子可通过Fenton样反应催化产生活性极强的羟基自由基，导致蛋白质氧化损伤，进而影响其功能，甚至与某些神经退行性疾病的发生发展相关。因此，精确调控铜的结合与防止其介导的氧化损伤至关重要。

一个核心的、悬而未决的问题是：在铜结合蛋白中，那些直接参与铜配位的氨基酸残基（如Met）是否比非配位残基更容易被氧化？铜的结合本身又会如何改变这些残基的氧化敏感性？传统的氧化剂如过氧化氢（H₂O₂）虽能特异性氧化Met，但在研究载铜蛋白时，会因引发铜依赖的Fenton化学反应，产生缺乏残基特异性的羟基自由基，导致蛋白降解和非特异性氧化，使得难以精确量化特定Met位点的本征氧化敏感性。这限制了对铜蛋白氧化调控机制的深入理解。

为了突破这一瓶颈，由Lionel Tarrago和Pascal Arnoux共同领导的研究团队，聚焦于一个重要的细菌铜伴侣蛋白——PcuC。该蛋白参与细胞色素c氧化酶（Cox）的组装，其序列中包含一个典型的铜结合位点（由两个His和两个Met构成，即H51x_nM63x₂₂H86xM88模体）以及一个富含Met和His的无序C端延伸区，是研究铜配位与Met氧化敏感性相互作用的理想模型。研究人员创新性地采用了一种甲硫氨酸特异性的氧氮杂环丙烷（oxaziridine）化学探针，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和蛋白质晶体学技术，首次实现了对PcuC蛋白在载铜（Cu-bound）与非载铜（apo）两种状态下，各个Met残基氧化敏感性的精确定量Mapping，并揭示了其背后的结构基础。相关研究成果发表在《Redox Biology》上。

为开展研究，作者运用了几个关键技术方法：首先，利用¹⁸O标记的过氧化氢（H₂¹⁸O₂）和自行合成的氧氮杂环丙烷探针，分别对apo-PcuC和Cu-PcuC进行氧化/标记处理，通过控制时间或探针浓度梯度，进行定量分析。其次，通过高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）并结合串联质谱标记（TMT）技术，对胰蛋白酶酶解后的肽段进行定性和定量分析，精确计算每个Met残基的氧化/标记百分比。第三，利用X射线晶体学技术，解析了apo-PcuC和Cu-PcuC的高分辨率三维结构，揭示了铜离子的配位模式。第四，结合AlphaFold2结构预测模型，分析了Met残基的溶剂可及性（solvent exposure）和局部静电荷分布，并与氧化敏感性数据进行关联分析。

2.1. PcuC脱辅基蛋白的甲硫氨酸残基具有不同的氧化敏感性

研究人员首先在apo-PcuC中验证了其Met的可氧化性。该蛋白包含8个Met残基（Met25, Met61, Met63, Met88, Met90, Met128, Met132, Met135）。使用1000倍摩尔当量的H₂¹⁸O₂进行时间梯度氧化实验并结合LC-MS/MS分析发现，不同Met残基表现出显著差异的氧化敏感性。Met25几乎不被氧化，而位于无序C末端的Met135氧化最为迅速和彻底（60分钟时约93%被氧化）。属于铜配位位点的Met63也表现出较高的敏感性（约45%被氧化），而另一个配位残基Met88的氧化水平则相对较低。Met132的氧化动力学曲线呈现独特的延迟上升模式，提示其可能是在高敏感性残基（如Met135）被氧化后才成为氧化靶点。这表明在天然状态下，PcuC中不同位置的Met其氧化敏感性存在固有差异。

2.2. 氧氮杂环丙烷探针对甲硫氨酸的反应性与过氧化氢相似

为了能够在载铜蛋白中特异性量化Met氧化而不受Fenton反应干扰，研究团队使用了氧氮杂环丙烷探针。他们先在apo-PcuC上验证该探针的有效性。通过将蛋白与不同浓度（0-10当量）的探针孵育，并量化每个Met的标记水平，发现其产生的标记模式与H₂^{18O₂氧化的结果高度相似：Met25仍最难被标记，Met135最易被标记。尽管在Met61、Met63和Met90的敏感度排序上存在细微差别，但总体趋势一致。这表明氧氮杂环丙烷探针能够有效模拟H₂O₂对Met的氧化，是一种可靠且特异的工具，可用于在复杂体系（如含金属蛋白）中评估Met的氧化敏感性。}

2.3. 铜结合显著改变PcuC甲硫氨酸的氧化敏感性

随后，研究人员将探针应用于Cu-PcuC。结果显示，铜的结合极大地改变了Met的氧化敏感性模式。最显著的变化是，在apo状态下几乎不反应的Met25在载铜状态下变得可被标记。更重要的是，两个铜配位Met残基（Met63和Met88）的标记水平显著增加，分别提高了2.1倍和3.5倍。此外，Met90的敏感性也明显增强。相反，在apo状态下最敏感的Met135，其标记水平相对下降。这些变化表明，铜配位通过改变Met硫原子的电子密度和/或侧链构象，直接增强了其氧化敏感性。其他非配位Met敏感性的变化可能源于配位Met氧化后引起的蛋白构象扰动。

2.4. PcuC在典型铜结合位点协调两个铜离子

为了从结构角度理解上述氧化敏感性的变化，研究人员解析了apo-PcuC（分辨率1.05 ?）和Cu-PcuC（分辨率2.75 ?）的晶体结构。结构显示，apo-PcuC呈现一个典型的七链β-桶状折叠，但其Ala55-Met61环区和Arg124开始的C端延伸区（含Met128, Met132, Met135）在电子密度图中无法解析，提示这些区域具有柔性。在Cu-PcuC结构中，发现了两个铜离子（Cu1和Cu2）结合在经典的配位位点，而无序的C端并未参与配位。Cu1由Met88的Sδ、His86的Nδ、一个水分子（连接至His51）以及一个来自结晶缓冲液的柠檬酸分子配位。Cu2则由His53和同一个柠檬酸分子的三个羧基氧原子配位。这一发现表明PcuC可以不依赖C端区域而结合两个铜离子，为理解其铜伴侣功能提供了新的结构见解。

2.5. 甲硫氨酸氧化敏感性与折叠区的溶剂暴露度相关，但与未折叠C端延伸区的正电荷相关

最后，研究者将氧化敏感性与结构特征进行关联分析。对于位于折叠结构域的Met（Met25至Met90），其氧化敏感性（无论是H₂^{18O₂还是探针的结果）与溶剂可及性呈正相关，即暴露在溶剂表面的面积越大，越容易被氧化。然而，对于位于无序C端延伸区的三个Met（Met128, Met132, Met135），情况则完全不同。尽管它们都具有高溶剂可及性，但其氧化敏感性却与溶剂暴露度呈负相关。进一步分析发现，这三个Met的氧化水平与其硫原子周围5.5 ?范围内的局部正电荷强度呈强正相关。带正电荷的氨基酸（如赖氨酸）环境可能通过静电相互作用，稳定了氧化过程中产生的带负电的硫氧化物过渡态或产物，从而促进了氧化反应。因此，在PcuC中，折叠区域的Met氧化敏感性主要由溶剂可及性决定，而无序区域的Met氧化敏感性则由局部正电荷环境主导。}

该研究通过巧妙的化学探针设计结合多组学技术，成功量化了铜伴侣蛋白PcuC在不同状态下的Met氧化敏感性图谱。结论表明，铜配位并非普遍性地使所有Met更易氧化，而是特异性增强了其直接配位位点（Met63和Met88）的敏感性。更重要的是，研究揭示了决定Met氧化敏感性的因素具有结构上下文依赖性：在有序结构域取决于溶剂可及性，而在无序区域则受局部静电位点调控。这一发现突破了以往主要关注溶剂可及性的认知。本研究发展的氧氮杂环丙烷探针策略，为在生理相关条件下（包括存在金属离子的情况）精确绘制蛋白质组水平的Met氧化敏感性图谱提供了强大、特异的工具。这不仅对理解细菌中铜伴侣蛋白的功能调控及其在氧化应激下的稳定性有重要意义，也为研究其他金属蛋白（如与神经退行性疾病相关的α-突触核蛋白和朊蛋白）中金属介导的氧化损伤机制提供了新思路和新方法。未来，通过在体内验证关键氧化敏感位点（如Met135）的功能，将有望揭示其在抵御铜应激、维持细菌呼吸作用中的潜在“氧化还原缓冲”角色。