《npj Precision Oncology》：Validation of a methylation-based, tissue-free MRD assay in colorectal cancer patients from the GALAXY study
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本研究针对结直肠癌(CRC)术后微小残留病(MRD)检测的临床需求，验证了一种名为Latitude的、基于DNA甲基化的无组织循环肿瘤DNA(ctDNA)检测方法。通过对GALAXY研究中195例患者1,230个时间点的数据分析，研究发现ctDNA阳性与显著更差的36个月无病生存率(DFS)相关（MRD窗口：HR=10，P<0.001；治疗后监测窗口：HR=31.9，P<0.001）。该检测在MRD窗口的灵敏度为58.5%，在未接受辅助化疗(ACT)的患者中特异性达100%。纵向监测显示，其对复发的灵敏度提升至84.4%。重要的是，研究证实ctDNA阳性患者能从ACT中显著获益(adj. HR=0.014, P<0.0001)，而ctDNA阴性患者则无显著获益。该无组织MRD检测展现了强大的预后和预测价值，为CRC个体化治疗提供了新工具。
在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是第三大常见癌症和第二大癌症相关死亡原因。尽管对于II期和III期CRC患者，手术切除是标准治疗，但术后仍有超过30%的患者会出现复发。因此，准确识别术后存在微小残留病(Minimal Residual Disease, MRD)的高复发风险患者，并指导其接受辅助化疗(Adjuvant Chemotherapy, ACT)，同时避免对低风险患者进行过度治疗，是当前临床实践中的关键挑战和未满足的需求。
循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)作为一种新兴的生物标志物，为MRD检测带来了希望。传统的“肿瘤知情”(tumor-informed) ctDNA检测方法虽然灵敏特异，但需要获取患者的肿瘤组织进行测序，这增加了时间、成本和操作复杂性，尤其在肿瘤组织不可用或质量不佳时受到限制。因此，开发一种不依赖肿瘤组织、即“无组织”(tissue-free)的ctDNA检测方法，具有重要的临床意义。
发表在《npj Precision Oncology》上的这项研究，旨在验证一种名为Latitude的、基于DNA甲基化(methylation-based)的无组织MRD检测方法在CRC患者中的临床表现。该研究利用了大型观察性研究GALAXY（CIRCULATE-Japan试验的一部分）的样本和数据，重点评估了该检测方法在预测复发风险和指导ACT决策方面的价值。
为开展研究，研究人员从GALAXY研究的6,061名可手术切除CRC患者中，依据预设统计计划筛选出195名病理分期为I-IV期的患者进行分析，这些患者共提供了1,230份血浆样本，中位随访时间为28个月。研究采用的核心技术方法是Latitude检测，这是一种基于下一代测序(Next Generation Sequencing, NGS)的技术，其工作流程包括：从血浆中提取细胞游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)并构建文库；通过NGS靶向检测与CRC相关的差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions, DMRs)；最后利用专有的机器学习算法对测序数据进行分析，将样本分类为ctDNA阳性或阴性。该检测在开发阶段涵盖了具有不同临床病理特征的样本，以确保其标志物面板的广泛适用性。统计分析方面，研究定义了MRD窗口（术后2-10周，开始ACT前）和确定性治疗后监测窗口（ACT结束后4周或术后若无ACT则从MRD窗口开始直至末次随访或复发），主要终点是无病生存期(Disease-Free Survival, DFS)，并采用了Cox比例风险模型和Kaplan-Meier生存分析等方法，并考虑了 immortal time bias 等偏倚的控制。
Association of ctDNA status in the MRD window with DFS
在MRD窗口内，187名患者有可用的ctDNA结果。其中23.0% (43/187)为ctDNA阳性。结果显示，ctDNA阳性患者的复发率高达88.4% (38/43)，而阴性患者仅为18.8% (27/144)，风险比(Hazard Ratio, HR)为10.0。ctDNA阳性患者的36个月DFS率仅为11.6%，显著低于阴性患者的79.0%。该检测在MRD窗口的灵敏度（检出复发患者的能力）为58.5% (38/65)，而在未接受ACT的非复发患者中，特异性（正确识别未复发患者的能力）达到100% (63/63)。多变量分析进一步证实，ctDNA阳性是预测DFS较差的最显著预后因素(HR=8.87)。
Association of ctDNA status in the post-definitive treatment surveillance window with DFS
在确定性治疗后监测窗口内，对190名患者进行了纵向监测。ctDNA阳性率为33.7% (64/190)，其中84.4% (54/64)发生复发，而连续ctDNA阴性的患者复发率仅为7.9% (10/126)，HR高达31.9。纵向监测将检测复发的灵敏度提升至84.4%，同时在患者水平和样本水平均保持了高特异性（分别为92.1%和97.2%）。多变量分析再次表明，此窗口期的ctDNA阳性是与不良DFS相关的最强预后因素(HR=20.59)。
Association of ACT and MRD status with DFS, and the impact of on-treatment ctDNA dynamics
针对高风险的II期和III期CRC患者，研究分析了ACT疗效与ctDNA状态的关系。结果显示，ctDNA阳性患者从ACT中获得了显著的生存获益（调整后HR=0.014），而ctDNA阴性患者则未观察到ACT的显著益处。相互作用检验表明，ACT的疗效因ctDNA状态不同而有显著差异。此外，在ACT治疗期间，ctDNA持续阳性或出现一过性转阴后又阳性的患者，其复发风险显著高于那些ctDNA持续阴性或经ACT后转阴的患者(调整后HR=27.30)。
Association of any time ctDNA positivity with sites of recurrence and lead time to recurrence
研究还分析了ctDNA状态与复发部位及预警时间的关系。在术后任何时间点ctDNA阳性的复发患者中，肝转移最为常见（43.9%）。从首次ctDNA阳性到临床影像学确认复发的中位预警时间(lead time)为4.6个月，为临床干预提供了宝贵的时间窗口。
综上所述，这项研究证实，基于甲基化的无组织MRD检测方法Latitude能够有效预测I-IV期CRC患者术后的复发风险。其在MRD窗口和纵向监测窗口均表现出强大的预后价值，ctDNA阳性与极差的DFS显著相关。更重要的是，该检测具有预测ACT获益的潜力，能够识别最可能从辅助化疗中受益的患者群体，从而为实现CRC的个体化精准辅助治疗提供了重要工具。这种不依赖肿瘤组织的检测方法，在肿瘤样本不可及或需要快速获得结果的情况下，为临床医生提供了新的选择。研究结果支持在未来开展前瞻性随机试验，进一步探索基于这种ctDNA检测的指导性治疗策略对可手术CRC患者的价值。
