利用新型单克隆抗体开发并验证了一种用于检测Cyenopyrafen的间接竞争性ELISA方法

《Talanta》：Development and Validation of an Indirect Competitive ELISA for Cyenopyrafen Detection Using a Novel Monoclonal Antibody

【字体：大中小】 时间：2026年01月20日 来源：Talanta 6.1

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　　环吡兰酮高效检测试剂盒开发及验证：成功构建高特异性抗体检测试剂盒，IC50达32.75 ng/mL，检测范围2.33-293.19 ng/mL，交叉反应率<0.1%，与UPLC-MS/MS法相关性R2>0.95，适用于柑橘、苹果等农产品残留检测，为监管体系提供新工具。

谭宇岚|郑杰新|徐波|丹克瑞|曹春雷|孙峰|赵启阳|何月|李静|崔永亮|张瑶海

中国农业与农村事务部柑橘果实质量与安全控制重点实验室，西南大学，重庆，400712，中国

摘要

氰吡拉芬是一种有效的吡唑类杀螨剂，用于控制多种作物上的螨虫。本研究制备了针对氰吡拉芬的高亲和力单克隆抗体，并开发了一种高通量间接竞争性酶联免疫吸附测定（ic-ELISA）方法，该方法在灵敏度、特异性和重复性方面均得到了验证。ic-ELISA的IC₅₀值为32.75 ng/mL，动态范围为2.33-293.19 ng/mL，与相关杀螨剂的交叉反应率可忽略不计（<0.1%）。在柑橘样本中的回收率为88.18%–105.89%。ic-ELISA的结果与UPLC-MS/MS的结果之间存在强相关性（R² > 0.95），这突显了该检测方法的可靠性。这种免疫测定方法为检测柑橘和苹果样本中的氰吡拉芬提供了一种可靠的方法，并可能为更广泛的应用提供基础，具有潜在的监管框架价值。

引言

氰吡拉芬是由日产化学公司开发的一种新型吡唑类杀螨剂[1]，能有效控制水果、茶叶和蔬菜上的多种螨虫[2]。它通过代谢激活转化为羟基形式[3]来发挥其作用。氰吡拉芬的羟基衍生物通过选择性靶向电子传递链（ETC）中的线粒体复合物II（琥珀酸脱氢酶，SDH）来发挥作用。这种相互作用抑制了琥珀酸的氧化，导致电子流中断，进而通过破坏质子梯度驱动的ATP合成而不可逆地抑制线粒体呼吸[4]。其叔丁基酯基团水解后，氰吡拉芬被代谢激活为这种生物活性衍生物，进一步显示出对SDH的强抑制作用。这种干扰直接阻碍了电子向泛醌的转移，从而解耦了氧化磷酸化过程并耗尽了细胞能量储备[5]。

氰吡拉芬已在中国、韩国和日本等主要农业市场注册，用于防治苹果、梨等果树上的红蜘蛛侵害。由于其良好的安全性、低哺乳动物毒性和高杀螨效果，该化合物符合现代农业对可持续害虫管理的优先要求。在中国，氰吡拉芬已正式注册用于四种作物：芸豆、柑橘树、苹果树和草莓。中国监管机构为苹果中的氰吡拉芬制定了2 mg/kg的临时最大残留限量（MRL）。在日本，32种食品中的氰吡拉芬MRL为0.05–60 mg/kg。而在韩国，55种食品的MRL为0.05–30 mg/kg[6]。相比之下，食品法典和欧洲食品安全委员会尚未为任何食品中的氰吡拉芬制定MRL。

许多研究探讨了氰吡拉芬在蔬菜和水果中的消解行为和分析方法[7]。具体而言，先前的研究通过结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）[8]的QuEChERS方法成功测定了这些产品中的氰吡拉芬残留量[1]。尽管UPLC-MS/MS具有高灵敏度和准确性[9][10]，但它需要操作人员具备专业技能且仪器成本较高[11]。多克隆抗体[12]、单克隆抗体和纳米抗体[13]的发展使得针对蛋白质和小分子的抗体数量不断增加[14]。ELISA利用具有高特异性和灵敏度的抗体[15]，已在医学诊断[16]、食品安全监测和环境污染物追踪[11]等多个领域得到广泛应用。

迄今为止，尚未有专门针对氰吡拉芬的抗体或免疫测定方法报道。本研究的目的是设计并合成氰吡拉芬的半抗原，制备高亲和力单克隆抗体，并建立一种灵敏的ic-ELISA方法，用于定量农业和食品基质中的氰吡拉芬残留量。

试剂

氰吡拉芬购自日产化学公司。分析级4-(溴甲基)苯甲酸甲酯、氢氧化钠（NaOH）、4-溴乙酸乙酯、过氧化氢（H₂O₂）、四甲基联苯胺（TMB）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、无水硫酸镁（MgSO₄）、硫酸（H₂SO₄）和盐酸（HCl）由上海阿拉丁生化科技有限公司提供。弗伦德佐剂（包括完全型和不完全型）、山羊抗鼠IgG-HRP等试剂也由该公司提供。

氰吡拉芬半抗原的合成及完整抗原的制备

所得抗体的灵敏度和特异性受到半抗原结构的显著影响[19]。在蛋白质偶联过程中，理想的半抗原应尽可能保持目标分子的结构完整性[20]。此外，半抗原需要包含一个间隔臂，以确保目标分子在蛋白质表面的最佳可及性[21]。在本研究中，氰吡拉芬本身缺乏活性基团，但

结论

本研究成功合成了三种氰吡拉芬半抗原。采用活性酯法制备了免疫原Hapten-C-BSA，以及同源涂层抗原Hapten-C-OVA和异源涂层抗原Hapten-A-OVA和Hapten-B-OVA。经过第五次免疫后，通过细胞融合产生了单克隆抗体3D2。异源ic-ELISA的灵敏度高于同源版本，IC₅₀值为32.75 ng/mL

CRediT作者贡献声明

崔永亮：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。何月：监督，资源获取，资金筹措。赵启阳：验证，数据管理。孙峰：软件应用，实验研究。郑杰新：验证，实验研究。李静：实验研究。谭宇岚：撰写 – 原稿撰写，方法学设计，实验研究。张瑶海：监督，资源获取，项目管理，资金筹措，数据分析。丹克瑞：数据可视化，实验研究。