《Small Methods》：Selective Wettability–Driven Evaporation-Enhanced Redox Cycling for Robust and Ultrasensitive Detection of Viral Particles
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本文介绍了一种选择性润湿性驱动的蒸发增强氧化还原循环（SW-E2RC）生物传感平台，通过将亲水性传感区嵌入超疏水微柱阵列中，实现液滴自对准、被动浓缩和分析物富集。该技术解决了传统电化学生物传感器因液滴手动放置导致的信号变异问题，显著提升了检测灵敏度（检测限低至9.2×103copies/mL）和重现性，为SARS-CoV-2和H5N1等病毒的超灵敏、现场快速检测提供了新策略。
引言
传染病仍然是全球健康的持续挑战，COVID-19大流行和奥密克戎等高传播性变异株的出现，以及高致病性禽流感H5N1病毒等人畜共患威胁都证实了这一点。早期检测，特别是在症状前阶段和无症状感染期间的低病毒载量检测，对于防止广泛传播至关重要。然而，当前的金标准分子诊断方法，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），虽然灵敏度高，但需要专门的实验室、训练有素的人员且过程耗时，这限制了其在资源有限或现场环境中的快速、即时检测效果。
电化学生物传感器通过将生物识别事件转化为可测量的电信号，快速、选择性地检测目标分析物，为即时诊断提供了一种有前景的替代方案。这些设备因其低成本、操作简单且能集成到紧凑系统中而成为便携式和现场测试的理想选择。它们的小样本量要求、快速响应时间以及与微型化的兼容性使其能够直接在患者位置检测病原体，从而减少诊断周转时间并实现快速干预。然而，随着设备尺寸的缩小，性能可能会下降。减小传感面积通常会加剧扩散限制，其中分析物分子向电极表面的传输成为限制因素，这可能导致电化学信号减弱和灵敏度降低，尤其是在检测早期感染或无症状携带者中的痕量分析物（如病毒颗粒）时。
为了解决这些问题，已经开发了信号放大策略，如催化氧化还原循环、纳米结构电极和微流体限制，以克服传质限制并恢复微型生物传感器的灵敏度。研究小组最近表明，蒸发增强氧化还原循环（E2RC）可以通过在蒸发液滴中进行连续信号读数，突破微型电化学传感器典型的扩散极限，从而在约20分钟内检测到阿托摩尔浓度的病毒颗粒。液滴蒸发过程随着时间的推移进一步浓缩分析物，增加了传感界面处的局部浓度，并增强了超越被动扩散的传质。然而，E2RC平台依赖于精确的手动液滴放置以对准传感区域。液滴对准不当会降低重现性和灵敏度，尤其是在精确移液可能具有挑战性的现场条件下。
研究表明，设计表面润湿性可以解决这些问题。例如，Zhang等人证明了铁磁流体注入表面结合磁驱动可以精确引导和定位液滴；Wallace等人开发了使用确定性（随机）柱阵列功能化银胶体的超疏水（SHP）表面增强拉曼光谱（SERS）基底，其平台通过在纹理表面上蒸发液滴实现了超过100倍的分析物浓缩。这些发现凸显了工程化/选择性润湿性在提高生物传感系统（包括电分析设备）灵敏度和可靠性方面的潜力。
结果与讨论
超疏水表面设计
在第一代E2RC设备中，用户必须手动将每个液滴对准几乎精确的传感器位置，这引入了可变性并限制了平台在实际诊断中的可靠性。为了解决这个问题，提出的SW-E2RC设备将传感单元与工程化的微柱基超疏水（SHP）表面相结合。设备的大部分区域覆盖着微柱基SHP区域，但中央传感区被有意保持非结构化和亲水性，以允许通过氧化还原循环进行稳健传感。表面润湿性的这种差异是一个关键设计特征：SHP区域排斥液滴并将其导向亲水区，液滴在该区域被钉扎并在蒸发和传感过程中保持居中。
超疏水性是一种表面现象，当液滴接触纹理表面时呈现近乎球形的形状，其特点是高表观接触角（≥150°）和低接触角滞后。这种现象是由于液体和固体之间的粘附力降低，使得液滴能够保持在固体和空气的组合之上。此类表面表现出优异的防水性，特别适用于需要液滴限制、自清洁或改善传输特性的应用。在生物传感中，SHP表面能够实现微滴的受控蒸发，同时最大限度地减少不希望的润湿或钉扎效应。
通过接触角分析和液滴形态跟踪评估了微柱阵列的超疏水行为。表面的润湿性由平衡接触角θ0决定，该角度表征了静态条件下液滴与固体表面的相互作用，如杨氏方程所描述。研究在毛细作用主导的范围内进行操作，该范围由无量纲邦德数（Bo）表征，该数比较了重力与表面张力。在这种情况下，表面张力主导重力，液滴在界面能的作用下呈现准球形。因此，杨氏关系在本案例中仍然适用。
然而，虽然杨氏方程严格适用于光滑且化学均匀的表面，但工程粗糙表面（如微柱阵列）通常表现不同。这种差异是由于液滴下方的气穴或液体完全渗透到表面纹理中而发生的，导致复杂的润湿状态，如Cassie-Baxter和Wenzel状态。基于Cassie-Baxter模型，结构表面上的表观接触角（θe）由公式定义，其中φs是该布局的固体分数。使用该模型，确定了一个最佳几何形状，其理论接触角约为170°，与实验测量值密切匹配。相比之下，未经处理的平坦表面表现出约100°的接触角。评估了两种柱设计（设计A和设计B），以及未经处理的平坦基底作为对比。时间推移图像和接触角测量表明，设计A在蒸发过程中保持了球形液滴形状，表明稳定的Cassie-Baxter状态。而设计B由于柱间距更密，表现出减小的接触角和较早的塌陷，表明存在部分转变。未经处理的表面由于缺乏微柱诱导的限制而表现出完全铺展和早期塌陷。重要的是，柱尺寸的选择不仅受理论模型指导，还受制于制造可行性。采用镍电镀与光刻胶模具实现了均匀的柱生长，实现了高通量的芯片级集成。
SHP表面与传感设备的集成
制造SW-E2RC的主要挑战之一在于集成两个高纵横比结构——微柱和3D传感微电极——两者都通过电沉积制造。开发的制造过程能够可靠地形成微柱和传感层，同时最大限度地减少它们之间的泄漏。核心E2RC设备（传感区域）的制造遵循先前建立的免纳米光刻方案，该方案结合标准光刻与模板驱动的镍（Ni）电沉积。在设备制造之后，沉积氧化铝（Al2O3）以电隔离传感电极和SHP微柱。由于Al2O3对光刻中使用的碱性显影剂敏感，因此在电介质顶部溅射Cr/W双层，作为光刻图案化的耐蚀刻硬掩模。重要的是，该Cr/W双层也是电镀Ni微柱所需的导电种子层。
在制造SHP表面的微柱之前，必须确保在传感区域或电接触垫上不形成任何柱。为了实现这一点，首先旋涂两层光刻胶以达到所需的厚度，然后进行光刻以确定传感区域和接触垫上的开口。随后，使用电感耦合等离子体反应离子刻蚀（ICP-RIE）依次去除暴露区域中的双金属种子层和下面的Al2O3。该过程暴露了传感区域和接触垫，同时在其他地方保留了Al2O3用于电隔离。对于柱电镀，旋涂并图案化聚合物层以形成用于镍沉积的圆柱形模具，所得柱的高度为12μm，直径为7μm，与优化几何形状一致以在液滴蒸发期间维持Cassie-Baxter润湿状态。在某些情况下，电沉积过程中柱间距变得比预期小，并且在某些区域，沉积超过光刻胶厚度导致柱缩短。这些不规则性可能损害表面的疏水性能，突出了在柱电沉积过程中精确控制的重要性。
为了理解传感区尺寸相对于SHP区域的相对间距（Δ）如何影响液滴钉扎，制造了具有不同Δ值的设备，并跟踪了接触角演化。虽然微柱区域表现出高表观接触角（θe≈ 170°），但中央传感区被有意保持非结构化，没有微柱，以允许直接电化学访问进行氧化还原循环。该未经处理的区域缺乏超疏水性所需的表面粗糙度，并显示出增加的润湿性，测量接触角约为100°，与光滑、亲水表面一致。因此，SW-E2RC表面的整体表观接触角与仅微柱区域相比有所降低。
当液滴分配到SW-E2RC表面上时，超疏水区域由于其高接触角和低粘附力而强烈排斥它。随着液滴向前移动，它被周围的SHP景观偏转，最终被亲水传感区捕获和钉扎，形成自对准且持续居中的配置。这种行为表明，自对准效果在所有测试配置中都是稳健的。没有超疏水限制，液滴自由铺展并随机粘附在手动分配的任何地方，没有特定的局部化，这强调了SW-E2RC设计在确保一致液滴限制和重现性方面的重要性。这种被动定心机制不仅提高了重现性，而且通过确保均匀的蒸发动力学和最大化分析物分子与传感器表面的相互作用来增强检测灵敏度。与第一代E2RC（用户必须手动对准液滴）不同，SW-E2RC无需外部辅助即可实现稳健自动的液滴局部化。
SW-E2RC设备的数值分析
在讨论SW-E2RC用于病毒检测的实验结果之前，进行了有限元分析（FEA）模拟，针对两个耦合机制：（i）蒸发驱动的氧化还原对富集，和（ii）选择性润湿性控制的液滴局部化，后者稳定了SW-E2RC中的氧化还原循环（RC）电流。在COMSOL Multiphysics中开发了一个瞬态模型，以更好地理解蒸发液滴中电化学系统所涉及的参数，并明确关注通过氧化还原循环的电流演化。
为了模拟液滴蒸发和随时间变化的体积（这对于COMSOL模拟是必要的），采用了幂律衰减函数来表示液滴体积。蒸发的固着液滴被假定经历准静态形状变换，保持钉扎的接触线。随着液滴体积减少，氧化还原分子（[Fe(CN)6]4?）的浓度相应增加。液滴体积的实验数据与动态液滴体积模型显示出良好的相关性。假设没有因吸附或氧化还原循环以外的反应导致分析物损失，时间依赖性浓度C(t)由质量守恒推导得出。在COMSOL模拟中，解析推导的C(t)被应用于液滴-电解质边界以驱动氧化还原反应，从而能够模拟实验观察到的蒸发增强的信号放大。
在通过实验证明液滴放置对灵敏度的重要性之前，进行了一项模拟研究：通过液滴富集边界与电极尖端之间的横向偏移（Δ?）参数化液滴位置。通过相对于电极移动富集边界场来设置Δ? ≈ 15 μm或20 μm，同时在所有情况下保持V(t)恒定。电流-周期结果表明，横向偏移较短（Δ? ≈ 15 μm）的液滴（表示未对准但更靠近电极的位置）由于扩散路径较短而产生更高的发生器和收集器电流。相反，具有较大偏移（Δ? ≈ 20 μm）的液滴（表示居中和对准的放置）由于扩散距离增加而产生较低的电流。这些结果支持了假设：选择性润湿性确保液滴持续钉扎在传感区中心，稳定氧化还原浓度和扩散几何形状以减少信号可变性。为了评估模拟的蒸发驱动信号放大与实验数据的一致性，绘制了连续周期上的归一化峰值电流。模拟和实验都表现出一致的电流放大，紧密遵循理论逆体积趋势C0/C(t)。这种相关性证实液滴蒸发是SW-E2RC中电流放大的主要驱动因素。
用mNP捕获的病毒颗粒验证SW-E2RC的性能
为了验证SW-E2RC的分析性能，测试了SARS-CoV-2（奥密克戎变体）和H5N1的灭活病毒颗粒。在将液滴添加到计数病毒颗粒之前，首先使用功能化病毒特异性抗体的磁性纳米颗粒（mNP）捕获目标病毒。与mNP孵育后，进行磁性分离和热洗脱，以在从初始样品中分离后分离mNP与病毒颗粒。热洗脱通过减少未结合mNP引起的噪声来提高灵敏度。对于SARS-CoV-2，初始库存浓度为1.16×109copies/mL（通过RT-PCR验证）。进行系列稀释以制备用于传感器和RT-PCR分析的样品。RT-PCR的Ct值随着稀释而增加，表明病毒基因组拷贝数减少。
为了理解选择性润湿对实时信号的影响，首先比较了使用SW-E2RC和E2RC的氧化还原循环信号的时间演化。结果显示，将选择性润湿性纳入E2RC设计在所有测试条件下持续产生更高的发生器和收集器电流。对于两种病毒（SARS-CoV-2和H5N1），SW-E2RC显示发生器和收集器电流随时间稳定增加，而E2RC显示较低的振幅和随时间较少的信号变化（表明灵敏度降低）。
接下来，通过定义信号ΔS来比较SW-E2RC与E2RC对病毒颗粒响应的分析性能。SW-E2RC的校准曲线表现出优异的线性，回归系数R2=0.99，而E2RC显示较弱的拟合（R2=0.82）。对于SW-E2RC，检测限（LOD）计算为9.2×103copies/mL。对于E2RC，LOD估计为4.11×107copies/mL，比SW-E2RC差至少三个数量级。除了显示更好的灵敏度和线性外，SW-E2RC表现出比E2RC更宽的动态浓度范围。这些结果进一步证实了SW-E2RC的增强检测性能，归因于其集成的基于选择性润湿性的液滴限制。
颗粒尺寸和表面电荷对检测灵敏度的影响
除了SARS-CoV-2，还测试了SW-E2RC平台对H5N1病毒的检测，以证明更广泛的适用性。与对SARS-CoV-2的响应类似，ΔS随着H5N1浓度的增加而减小。但值得注意的是，与SARS-CoV-2相比，SW-E2RC对H5N1的响应表现出更大的变异性和较低的灵敏度。假设对H5N1的响应弱于SARS-CoV-2与其物理和表面电荷特性的差异有关。为了验证这一假设，使用动态光散射（DLS）和Zeta电位（ζ）分析分别分析了SARS-CoV-2和H5N1病毒颗粒的流体动力学尺寸和表面电荷。
DLS测量显示，H5N1病毒颗粒的平均流体动力学直径超过1000 nm，显著大于SARS-CoV-2（<200 nm）。相反，Zeta电位测量显示，两种病毒具有相似的负表面电荷，表明在测试条件下具有可比的电泳迁移率。ζ电位的相似性意味着对电极表面的静电吸引不是影响检测的主要因素；相反，巨大的尺寸差异可能具有主导效应。正如前面详细说明的，SARS-CoV-2的ΔS值显示出清晰的、浓度依赖的抑制趋势，而H5N1的响应更不一致。认为这种差异源于E2RC设备的几何约束，该设备最初为<200 nm的颗粒（如SARS-CoV-2）设计。大得多的H5N1病毒粒子对亚微米叉指间隙（约500 nm间隙）的访问有限，降低了它们引起表面阻塞的能力，从而削弱了信号。这种解释与早期的珠子尺寸研究非常吻合，在该研究中，100 nm带负电荷的颗粒产生显著高于1 μm珠子的ΔS响应，而与表面电荷极性无关。在那项研究中，较大珠子与传感表面相互作用的减少归因于它们被限制电极区域的空间排阻，这与这里观察到的对H5N1病毒响应减弱机制类似。这些结果表明，虽然表面电荷在许多生物传感场景中会影响电泳吸引，但颗粒尺寸是影响当前设置中检测灵敏度的主要因素。这强调了在使SW-E2RC技术适应检测具有不同物理尺寸的病毒、细菌或其他生物目标时，将电极形状设计为接近目标分析物尺寸的重要性。
结论
在本研究中，开发并验证了SW-E2RC生物传感系统，该系统将选择性润湿性与蒸发增强氧化还原循环相结合。通过将亲水传感区集成在超疏水微柱晶格内，该系统实现了精确的液滴限制、通过蒸发增加分析物富集以及无需手动干预即可重现的自对准。使用可扩展且无需纳米加工的过程制造，SW-E2RC平台性能优于第一代E2RC设备，具有约103倍更好的LOD、更高的灵敏度、改进的线性度和更宽的动态范围。用SARS-CoV-2（尺寸<200 nm）和H5N1（尺寸约1 μm）病毒进行的验证揭示了与亚微米传感间隙相关的尺寸依赖性响应，对于尺寸更接近传感器临界尺寸（主要是发生器和收集器电极之间的间隙）的颗粒具有最佳灵敏度。动态光散射和Zeta电位测量证实了两种病毒具有相似的负表面电荷，表明尺寸驱动的空间可及性主要影响灵敏度差异。这些发现突出了SW-E2RC作为稳健、可调谐且现场就绪的诊断平台的潜力，能够在微升级样品中进行灵敏的病原体检测。除了这一特定应用，选择性润湿性原理可以广泛应用于其他微流体和生物传感平台。受控的表面异质性可用于精确液滴操纵、增强分析物预浓缩和提高各种生物传感器架构中的氧化还原循环效率，强调了SW-E2RC概念对于下一代诊断设备的更广泛相关性和适应性。
