《Virology》：Human parainfluenza virus type 3 viruses with the furin-susceptible motif at the cleavage site of the fusion protein arose from original wild strains during their propagation
in vitro
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本研究针对HPIV3融合蛋白(F蛋白)弗林蛋白酶敏感基序(VWFM)的来源争议，通过系统发育分析和体外传代实验，证实VWFM是病毒在低胰蛋白酶浓度条件下体外传代时产生的适应性突变，而非自然界的优势毒株，为正确解读历史病毒分离株数据和呼吸道病毒病原学研究提供了关键实验证据。
在病毒学研究领域，实验室中分离和传代的病毒毒株与其在自然界中真实流行的原始形态之间，有时会存在令人困惑的差异。人副流感病毒3型（Human Parainfluenza Virus Type 3, HPIV3）便是这样一个典型案例。HPIV3是引起儿童和成人呼吸道感染的重要病原体，其感染细胞的关键一步依赖于其融合蛋白（Fusion protein, F蛋白）的激活。F蛋白需要被宿主细胞的蛋白酶切割成F1和F2亚单位后，才具备介导病毒包膜与细胞膜融合的能力。早期研究（1990年以前）报道的HPIV3分离株中，很大一部分携带一种被称为“弗林蛋白酶敏感基序”（viruses with the furin-susceptible motif, VWFM）的氨基酸序列（如...R-K-R...或...R-R-R...），该基序能被细胞内广泛存在的弗林蛋白酶（furin）切割，使得病毒无需外源性胰蛋白酶（trypsin）即可在多种标准细胞系（如Vero、LLC-MK2）中有效复制。然而，近几十年来，对临床样本的直接基因组测序分析发现，自然界中流行的HPIV3毒株绝大多数并不携带VWFM（称为VWOFM），其F蛋白切割位点序列（如...R-T-E-R...或...R-T-G-R...）需要依赖外源性胰蛋白酶或呼吸道中特定的II型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases, TTSPs，如TMPRSS2）进行切割。这种巨大的反差提出了一个核心科学问题：历史上那些携带VWFM的毒株，究竟是曾经在自然界中广泛流行而后被取代，还是它们在实验室细胞培养过程中人为产生的适应性变异？这个问题对于准确理解病毒的进化、致病性以及正确解读基于实验室毒株的研究数据至关重要。尽管学术界普遍推测VWFM是实验室适应（laboratory-adapted）的结果，但缺乏直接、系统的实验证据来再现其从野生型毒株中产生的过程。为了解决这一长期存在的疑问，并明确VWFM产生的条件与机制，研究人员在《Virology》上发表了他们的研究成果。
为开展此项研究，研究人员整合了多种关键技术方法。他们对来自日本仙台1996年至2017年间的116株HPIV3临床分离株进行了F基因切割位点的基因型分析，并利用表达荧光唾液酸底物（BTP3-Neu5Ac）的多步复制（Multi-Step Replication, MSR）实验和蛋白质印迹（Western Blotting）对病毒的表型（是否依赖外源胰蛋白酶）进行了验证。研究人员从公共数据库（NCBI）和既往文献中收集了431株HPIV3的F基因序列，进行了大规模的基因型和系统发育分析，以追溯VWFM的历史分布和进化关系。最关键的部分是实验性诱导VWFM的产生：研究人员将15份临床样本、10株临床分离株和2株实验室标准株（均为VWOFM）分别在MNT-1细胞和Vero细胞中，于低浓度（2 μg/mL或5 μg/mL）或无外源胰蛋白酶的条件下进行连续传代培养（最多10代），并监测细胞病变效应（Cytopathic Effect, CPE）的出现。对传代过程中出现CPE的病毒进行Sanger测序，以检测F基因切割位点的突变。最后，对获得的突变株再次进行MSR实验和蛋白质印迹分析，以确认其基因型改变是否伴随表型的转换，即获得在不添加胰蛋白酶条件下的复制能力和F蛋白的自我切割能力。
3.1. 日本仙台HPIV3野外分离株的遗传和表型分析
研究人员首先对116株本地分离株进行分析，发现仅有一株（Sendai-H/2910/2003）携带VWFM（在P2位置为赖氨酸K），其余115株均为VWOFM（P2位置为谷氨酸E或甘氨酸G）。MSR实验表明，只有这株VWFM能在无外源胰蛋白酶的MNT-1细胞中有效复制并产生强烈的荧光信号，而所有VWOFM则完全依赖胰蛋白酶。这一结果完美匹配了基因型与表型，证实了VWFM与胰蛋白酶非依赖性复制能力的直接关联。
3.2. 既往研究中保存的HPIV3遗传信息
通过对431株历史毒株序列的分析发现，VWFM在1990年之前报告的毒株中占比较高（75%，12/16），但在1990年之后报告的毒株中仅占极低比例（3.6%，15/415）。这一显著差异强烈暗示，早期研究中高频出现的VWFM可能与当时的病毒分离培养方法有关。
3.3. 系统发育分析
构建的系统发育树显示，1990年前报告的VWFM聚集在一个亚支中，但与同期报告的VWOFM混杂，表明其聚类主要由分离年代而非VWFM特征决定。而1990年后零星报告的VWFM则分散在不同的进化支中，并未形成独立的聚类。本研究中唯一的VWFM（Sendai-H/2910/2003）也与2003年分离的其他VWOFM位于同一簇。这些结果表明，VWFM是零星、独立出现的，而非来自一个曾经占主导地位的独立进化谱系。
3.4. VWFM在VWOFM体外复制过程中的产生
为了直接验证VWFM可在体外传代中产生，研究人员将VWOFM毒株在低浓度或无胰蛋白酶的MNT-1或Vero细胞中连续传代。结果发现，1份临床样本、4株临床分离株和1株实验室参考株（Sendai-H/926/2012）在传代2至5次后，开始在不添加胰蛋白酶的条件下产生CPE。测序证实，这些病毒的F蛋白切割位点P2位置的氨基酸由谷氨酸（E，密码子GAA）通过单个核苷酸替换（G→A）变成了赖氨酸（K，密码子AAA），从而获得了VWFM基因型。对其中两株诱导产生的VWFM（源自Sendai-H/941/2014和Sendai-H/784/2016）进行表型验证，MSR实验和蛋白质印迹分析均证实，突变后的病毒确实能够在无外源胰蛋白酶的条件下完成多轮复制，并且其F0蛋白能被细胞内蛋白酶（很可能是furin）有效切割成有活性的F1蛋白，而它们的原始VWOFM亲本病毒则完全不具备这种能力。值得注意的是，Sendai-H/2910/2003这株唯一的天然VWFM分离株，其分离史恰好是使用了通常维持低胰蛋白酶浓度的Vero细胞和GMK细胞，这为“VWFM在特定培养条件下产生”的假说提供了间接但有力的支持。
本研究通过严谨的实验设计，首次直接、系统地证实了HPIV3的弗林蛋白酶敏感基序（VWFM）能够在体外细胞培养过程中，通过单个核苷酸突变，从缺乏该基序的野生型病毒（VWOFM）中自发产生。这一过程在低浓度或无外源胰蛋白酶的培养条件下被强烈选择，因为获得VWFM的病毒突变体能够利用细胞内广泛存在的弗林蛋白酶激活其F蛋白，从而在缺乏适宜VWOFM复制的蛋白酶环境中获得巨大的生长优势，并最终在病毒群体中占据主导地位。
研究结论深刻揭示了早期研究中高频报道的VWFM毒株很可能是特定实验室培养条件（如使用Vero细胞并在低胰蛋白酶浓度下维持）下的人工产物，而非历史上自然界中真正流行的优势病毒形态。这一发现澄清了HPIV3研究领域一个长期存在的困惑，强调了在病毒学研究，特别是基于临床分离株的研究中，详细记录和审慎考虑病毒传代历史及培养条件的极端重要性。它提示，基于可能含有实验室适应性突变的毒株所得出的关于病毒致病性、传播能力和宿主范围等结论，可能需要重新评估。此外，该研究也为理解其他呼吸道病毒（如流感病毒、冠状病毒）在细胞培养中的适应性进化提供了参考模型。更重要的是，该研究强化了野生型HPIV3在人体内复制主要依赖于呼吸道局部表达的TTSPs（如TMPRSS2）这一观点，这为开发针对宿主蛋白酶的抗病毒策略提供了理论依据，因为这些策略针对的是在自然感染中起关键作用的病毒激活通路，而非实验室人为引入的替代通路。总之，这项工作不仅解决了HPIV3研究中的一个具体历史问题，更对病毒分离、培养和特性研究的标准化实践具有普遍的指导意义。
