单细胞RNA测序揭示疫苗接种后牙鲆CD8α+细胞异质性及免疫保护机制

《Water Biology and Security》：Single-cell RNA sequencing reveals CD8α+ cell heterogeneity and immunity in vaccinated flounder ( Paralichthys olivaceus)

本研究针对鱼类疫苗接种后CD8+细胞的具体保护机制不明确的问题，通过开发牙鲆CD8α特异性抗体，结合单细胞RNA测序技术，系统解析了CD8α+细胞的异质性及其在DNA疫苗免疫后的功能分化。研究发现CD8α+细胞包含8个功能亚群，其中细胞毒性T细胞亚群通过上调IL-16和IL-18R等基因增强免疫应答，非T细胞亚群则通过吞噬作用参与病原清除。该研究首次在硬骨鱼类中揭示了CD8α+细胞的多元免疫角色，为鱼类疫苗研发提供了重要理论依据。

　　

在 aquaculture 领域，鱼类病害的防控一直是制约产业可持续发展的关键瓶颈。疫苗接种作为预防疾病的有效手段，其保护机制尤其在适应性免疫环节尚存诸多未知。硬骨鱼类作为最早具备适应性免疫的脊椎动物，其CD8⁺细胞在抗感染过程中扮演着核心角色，但这类细胞在疫苗接种后如何被激活、分化及发挥保护作用，仍缺乏系统研究。传统技术的局限性使得科学家难以精确捕捉CD8⁺细胞的异质性及其动态变化，这阻碍了高效疫苗的理性设计。

为破解这一难题，研究人员以重要经济鱼种牙鲆（Paralichthys olivaceus）为模型，聚焦CD8α⁺细胞在DNA疫苗免疫后的应答机制。他们首先成功克隆了牙鲆CD8α分子，并制备出特异性抗体，验证了其识别天然蛋白的能力。随后，利用该抗体分选疫苗接种并攻毒后头肾中的CD8α⁺细胞，通过10x Genomics单细胞RNA测序技术绘制了高分辨率细胞图谱。

研究发现，CD8α在牙鲆免疫器官中的分布具有组织特异性，头肾中比例最高（15.98%），且CD8α分子与CD3ε、CD8β及MHC-IIβ共定位，提示其表达不限于经典T细胞。单细胞测序进一步将CD8α⁺细胞划分为8个亚群，包括细胞毒性T细胞（CTLs1和CTLs2）、初始CD8⁺T细胞、CD4⁺CD8⁺T细胞、NKT样细胞、单核/巨噬细胞、B细胞以及树突状细胞样白细胞。伪时序分析显示，CD4⁺CD8⁺T细胞为发育起点，经初始CD8⁺T细胞分化为效应性CTLs亚群。

在DNA疫苗免疫组中，CTLs亚群显著上调IL-16和IL-18R表达，并富集于内质网蛋白加工、免疫应答等通路；非T细胞亚群（如B细胞和单核/巨噬细胞）则通过吞噬体和内吞途径增强病原清除能力。这些结果揭示了CD8α⁺细胞通过直接杀伤、细胞因子分泌和吞噬作用等多重机制协同发挥免疫保护的新范式。

关键技术方法

研究采用 scRNA-seq（10x Genomics平台）对流式分选的CD8α⁺细胞进行转录组分析，结合Harmony算法整合批次效应，通过Seurat软件进行细胞聚类和差异基因分析。伪时序轨迹采用Monocle 2/3和PAGA构建，基因功能注释通过GO和KEGG完成。实验样本为6月龄牙鲆（购自山东日照养殖场），接种pVAA DNA疫苗35天后攻毒Vibrio anguillarum，于攻毒后第7天采集头肾细胞。

3.1. 牙鲆CD8α抗体的开发与特异性验证

通过原核表达系统制备CD8α胞外区重组蛋白，免疫新西兰兔获得多克隆抗体。Western blot和质谱分析证实抗体可特异性识别24.97 kDa的天然CD8α蛋白，免疫荧光显示其与转染CD8α真核质粒的HINAE细胞共定位，验证了抗体的高亲和力与特异性。

3.2. CD8α⁺细胞的组织分布与共定位特征

流式细胞术检测发现CD8α⁺细胞在头肾、脾脏和外周血中的比例分别为15.98%、14.2%和5.2%。免疫荧光双标显示CD8α与T细胞标志CD3ε、CD8β及抗原呈递相关分子MHC-IIβ共表达，但不与CD4-1、CD4-2或IgM共定位，提示CD8α在牙鲆中广泛表达于T细胞及部分先天免疫细胞。

3.3. 疫苗接种与攻毒实验

pVAA疫苗免疫组在攻毒后存活率达57%，显著高于空载体对照组（29%），表明DNA疫苗诱导了有效的免疫保护。攻毒后第7天，头肾CD8α⁺细胞比例在免疫组与对照组间无显著差异（18.8% vs 17.4%），但细胞功能状态发生显著改变。

3.4. 单细胞测序揭示CD8α⁺细胞异质性

scRNA-seq鉴定出8个细胞亚群，包括两类CTLs（高表达GZMB、穿孔素）、初始CD8⁺T细胞、CD4⁺CD8⁺T细胞、NKT样细胞（表达NKTR）、单核/巨噬细胞（高表达CD209c、CSF3R）、B细胞（表达IgM）和树突状细胞样白细胞（高表达MHCII、LAMP3）。CD8α表达量以初始CD8⁺T细胞和NKT样细胞最高。

3.5. 非T淋巴细胞亚群的差异基因分析

B细胞和单核/巨噬细胞在免疫组中差异基因显著富集于吞噬体和内吞途径，而NKT样细胞和树突状细胞样白细胞差异基因较少，主要参与代谢通路，提示非T细胞亚群通过增强吞噬功能参与疫苗免疫。

3.6. T淋巴细胞亚群的发育轨迹与功能分化

伪时序分析显示CD4⁺CD8⁺T细胞为发育起点，分化为初始CD8⁺T细胞，进而形成CTLs1和CTLs2效应亚群。早期发育基因（如JUNB、ACTB）在初始阶段高表达，而效应阶段基因（如TBX21、GZMB）在CTLs中上调。

3.7. T淋巴细胞亚群的免疫应答特征

CD4⁺CD8⁺T细胞和初始CD8⁺T细胞富集核糖体和氧化磷酸化通路，支持细胞激活所需的能量代谢；CTLs1和CTLs2则显著富集免疫应答、蛋白加工等通路，并上调IL-16和IL-18R，表明效应T细胞通过细胞因子信号增强杀伤功能。

研究结论与意义

本研究首次在硬骨鱼类中系统阐明了CD8α⁺细胞的异质性及其在DNA疫苗免疫中的核心作用。CD8α表达不仅限于细胞毒性T细胞，还广泛存在于具有吞噬功能的先天免疫细胞中。疫苗接种后，CTLs通过上调IL-16/IL-18R信号通路增强效应功能，而非T细胞亚群通过吞噬作用协同清除病原。该发现突破了传统认知中CD8⁺细胞仅负责细胞毒作用的局限，揭示了鱼类免疫应答的复杂网络，为开发靶向CD8α⁺细胞的高效疫苗提供了新思路。论文发表于《Water Biology and Security》，对保障水产养殖业健康发展具有重要实践价值。