《Nature Communications》：Guardian ubiquitin E3 ligases target cancer-associated APOBEC3 deaminases for degradation to promote human genome integrity
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本研究揭示了UBR4、UBR5和HUWE1等E3连接酶通过靶向降解核定位的癌症相关APOBEC3（A3B和A3H-I）脱氨酶，限制其驱动的基因组超突变的新机制。研究人员通过CRISPR筛选和邻近标记技术发现，RNA结合状态决定A3蛋白被E3识别的方式，该守护系统在多种癌细胞和临床样本中验证可抑制APOBEC特征突变，为癌症基因组稳定性维持提供了新靶点。
在人类基因组中，APOBEC3（A3）家族细胞苷脱氨酶扮演着双重角色：一方面作为先天免疫的重要成员，通过诱变病毒cDNA抵抗逆转录病毒；另一方面，某些A3家族成员（如A3A、A3B和A3H-I）却可能"倒戈相向"，从细胞质穿梭至细胞核，引起人类基因组有害的超突变，进而促进癌症的发生发展。这类癌症相关A3蛋白驱动的超突变，已在超过70%的癌症类型和约50%的癌症基因组中发现了其特征性突变印记（如SBS2和SBS13），尤其在乳腺癌、肺癌和膀胱癌中尤为显著。然而，一个关键的科学谜团悬而未决：为何这些具有潜在破坏性的、不稳定的核定位A3蛋白（如A3B和A3H-I）在细胞内通常只能维持较低的水平，从而将其对基因组的威胁控制在有限范围内？是否存在特定的细胞"守护者"机制，主动维持这些"危险分子"的低浓度状态，从而保护我们的基因组完整性？如果这些"守护者"失效，是否会"解锁"A3驱动的超突变能力，加剧基因组不稳定性？
为了回答这些问题，由Irene Schwartz和Valentina Budroni等人领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项研究，他们通过系统的遗传学和蛋白质组学筛查，揭示了一个由特定泛素E3连接酶构成的"守护者"网络，该网络通过靶向降解癌症相关的A3蛋白，在维护人类基因组完整性中扮演着关键角色。
研究人员开展本研究主要运用了几个关键技术方法：首先，他们构建了基于CRISPR-Cas9的遗传筛选平台（利用双报告系统mCherry-A3H-II-P2A-EGFP-A3H-I），在全基因组范围内筛选调控A3H-I稳定性的E3连接酶；其次，运用TurboID（TID）邻近标记蛋白质组学技术，在活细胞中无偏倚地鉴定与A3H-I发生直接相互作用的蛋白质；第三，通过体外重构泛素化实验，使用纯化的重组蛋白验证E3连接酶对A3底物的直接泛素化活性；第四，利用突变读取测序（mutREAD sequencing）技术，精准定量分析基因编辑后细胞基因组中的APOBEC特征性突变负荷；此外，研究还结合了细胞分馏、蛋白质稳定性追踪（环己酰亚胺CHX追逐实验）、免疫共沉淀、分析超速离心等技术深入探讨分子机制。临床相关性分析则基于癌症基因组图谱（TCGA）和PCAWG计划的大型癌症患者基因组数据。
蛋白质组降解控制癌症相关A3s的蛋白水平
研究人员首先确认，与稳定的胞质A3s（如A3F、A3G、A3H-II）不同，癌症相关的A3A、A3B和A3H-I的细胞内蛋白水平确实受到蛋白酶体降解的严格控制。蛋白酶体抑制剂（如EPOX、MG132）处理能显著提高这些核定位A3s的蛋白量，而不影响胞质A3s。他们选择A3H作为模型，因为其单核苷酸多态性（SNP）决定了两种主要单倍型：不稳定的、核相关的A3H-I和稳定的、胞质为主的A3H-II。实验表明A3H-I半衰期极短（RKO细胞中约15分钟），而A3H-II非常稳定。这种降解是蛋白酶体特异性的，且A3H-I的降解依赖于其多个赖氨酸残基的泛素化。
E3连接酶UBR4、UBR5和HUWE1分别介导A3B和A3H-I的降解
通过针对泛素-蛋白酶体系统基因的CRISPR筛选，研究团队发现敲低UBR4、UBR5或HUWE1能特异性提高EGFP-A3H-I的报告信号，而不影响mCherry-A3H-II，提示这三者是A3H-I降解的关键E3连接酶。验证实验表明，单独敲除任一E3均能提高内源性A3B蛋白水平（2.5-4倍），而同时敲除三者对A3B水平的提升具有叠加效应（约6倍），说明它们独立发挥作用。值得注意的是，A3A的降解不依赖于UBR5或HUWE1，但部分依赖于UBR4，提示其降解机制存在差异。
UBR5和HUWE1在细胞内与A3H-I及其他不稳定A3脱氨酶形成复合物
TurboID邻近标记蛋白质组学结果进一步证实了遗传筛选的发现。与对照（TID-GFP）或稳定单倍型（TID-A3H-II）相比，UBR5和HUWE1被特异性富集在TID-A3H-I的相互作用组中。免疫共沉淀实验也证实UBR5和HUWE1能与外源表达的A3H-I和A3B发生特异性相互作用，而不与A3H-II或A3A结合。这些结果表明UBR5和HUWE1很可能直接识别并泛素化A3B和A3H-I。UBR4虽在遗传筛选中是重要因子，但未在相互作用组中显著富集，暗示其可能以更间接的方式（如作为泛素链延伸E4连接酶）发挥作用。
RNA结合保护A3s免受E3连接酶结合和泛素化
之前研究表明，RNA结合对于A3s的胞质滞留和抗病毒功能至关重要。本研究发现，RNA结合同样是决定A3蛋白稳定性的关键开关。A3H-I和A3H-II之间的稳定性差异由第105位氨基酸（A3H-I为甘氨酸G，A3H-II为精氨酸R）决定。将A3H-I的G105突变为R（G105R），可使其变得稳定且胞质定位，反之，A3H-II的R105G突变则使其变得不稳定且部分核定位。重要的是，破坏A3H-II或A3G的RNA结合能力（通过点突变W115A、R175/176E for A3H-II；或6M、FWKL等突变 for A3G）会使原本稳定的蛋白变得不稳定，被蛋白酶体降解，并被UBR5/HUWE1识别和泛素化。细胞分馏实验表明，这些不稳定的A3变体主要在细胞核内被降解。用RNase A处理细胞裂解液可以增强UBR5/HUWE1与A3B的结合，说明细胞中部分A3B因结合RNA而处于稳定状态，未被结合的则成为E3的底物。强制核定位（NLS融合）或强制胞质定位（NES融合）实验提示，A3蛋白的稳定性主要取决于其RNA结合界面是否暴露，而非绝对意义上的亚细胞定位。
A3B和A3H蛋白的RNA结合决定了它们在体外被E3连接酶识别和泛素化
为了在无细胞体系中直接验证RNA结合对E3识别的调控，研究人员在体外重构了泛素化系统。由于从大肠杆菌中纯化的野生型A3H-I和A3H-II都结合了大量细菌RNA，而一个设计的不结合RNA的A3H-II突变体（A3H-II-RBM）则呈RNA游离状态。体外泛素化实验显示，UBR5和HUWE1能直接对A3H-II-RBM以及（程度较轻的）A3H-I进行多聚泛素化，而对RNA结合能力更强的A3H-II的修饰水平最低。如果在反应中加入RNase A去除RNA，则A3H-I和A3H-II的泛素化水平会显著增强，达到与A3H-II-RBM相当的程度。分析超速离心和分子筛分析证实，UBR5和HUWE1只能与RNA游离状态的A3H（无论是突变体还是经RNase处理的野生型）发生直接相互作用。类似地，纯化的不结合RNA的A3B CD1和CD2结构域也能被UBR5、HUWE1和UBR4有效泛素化，而A3A的泛素化程度很低。这些数据强有力地支持了"RNA结合通过空间位阻阻止E3连接酶接近A3蛋白的识别界面"这一模型。
E3连接酶缺失或突变增加APOBEC特征突变
功能上，在RKO细胞（表达内源性A3B）中敲除UBR5或HUWE1，即使在没有外源表达A3H-I的情况下，也能通过提高内源性A3B水平而增加APOBEC特征突变（SBS2/SBS13）。在表达外源A3H-I的背景下，敲除UBR4或HUWE1同样显著增加了APOBEC特征突变负荷，且突变序列上下文（TpCpN）符合APOBEC特征。对癌症基因组数据（PCAWG）的分析发现，与野生型相比，携带UBR5或HUWE1基因突变的癌症样本中，APOBEC特征突变（SBS2/SBS13）的占比显著更高，这表明E3连接酶的功能丧失在人类癌症中确实与APOBEC驱动的突变积累相关。
研究结论与讨论部分强调，这项工作揭示了一个此前未知的、由UBR5和HUWE1为核心构成的E3连接酶网络，它们作为"基因组守护者"，通过识别处于非RNA结合状态的癌症相关A3脱氨酶（A3B和A3H-I），并将其靶向蛋白酶体降解，从而有效限制这些蛋白在细胞核内的积累及其引发的基因组超突变。UBR4可能作为E4连接酶辅助放大泛素化信号。这种降解机制具有精巧的选择性：它特异性地靶向那些因RNA结合减弱而易位至核内、从而具有潜在基因组破坏风险的A3蛋白（如A3B、A3H-I），而不会影响那些主要结合RNA、驻留胞质、执行抗病毒功能的稳定A3成员（如A3H-II、A3G）。这种调控机制在维持有效的抗病毒防御和防止自身基因组突变之间取得了关键平衡。该研究的发现具有多重重要意义：首先，它阐明了A3蛋白稳态调控的一个核心机制，深化了对癌症中APOBEC突变特征起源的理解；其次，UBR5和HUWE1等E3连接酶的突变状态或功能异常，可能作为预测癌症APOBEC突变负荷和基因组不稳定性的潜在生物标志物；此外，考虑到蛋白酶体抑制剂在癌症治疗中的广泛应用，该研究提示需要关注此类药物可能通过稳定A3蛋白而加剧肿瘤突变负荷的潜在风险；最后，该研究揭示的E3-A3轴可能为开发新的诊断工具或治疗策略（如调节E3连接酶活性以控制突变速率）提供了新的靶点和思路。
