《Nature Communications》：Central amygdala single-nucleus atlas reveals chromatin and gene transcription dynamics in human alcohol use disorder
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本研究针对酒精使用障碍(AUD)的分子机制不明确的问题，通过单核多组学测序(snMultiome-seq)技术，对50例人死后脑中央杏仁核(CeA)约17.4万个细胞核进行了染色质可及性(snATAC-seq)和基因表达(snRNA-seq)分析。研究发现抑制性神经元(INH)在AUD中最易受损，揭示了大量差异表达基因(DEGs)和顺式调控元件(CREs)，并识别出KLF家族转录因子在调控AUD风险基因中的关键作用。该研究构建了首个AUD人CeA单细胞多组学图谱，为理解AUD病理生理学提供了重要资源。
酒精使用障碍(Alcohol Use Disorder, AUD)是一种常见的、具有中度遗传性的神经精神疾病，它不仅导致严重的社会和职业功能障碍，还伴随着多种医学共病和死亡率增加。尽管全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)已鉴定出许多与AUD相关的风险基因位点，但遗传风险如何转化为大脑分子病理改变，至今仍不清楚。这其中的复杂性源于急慢性酒精暴露的直接和间接影响，以及AUD相关的其他效应（如营养不良）的干扰。中央杏仁核(Central Amygdala, CeA)作为杏仁核的主要输出核团，主要由抑制性神经元构成，在酒精和其他成瘾性药物的强化效应中扮演关键角色。然而，此前尚未有针对AUD患者CeA的单细胞多组学研究。
为了填补这一空白，由Matthew J. Girgenti和Jing Zhang共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们利用单核多组学测序(snMultiome-seq)技术，对来自50名捐赠者（22名AUD患者和28名对照）的死后人脑CeA组织进行了高分辨率分析，共获得了174,188个高质量细胞核的数据，平均每个细胞核检测到6,028个转录本。这项研究旨在绘制AUD状态下CeA的细胞类型特异性基因表达和染色质可及性图谱，从而深入解析AUD的基因调控机制。
研究人员采用定制化的生物信息学流程对每个基因组层进行分析和整合。通过snMultiome技术（10X Chromium Single Cell Multiome ATAC+Gene Expression），他们能够同时从同一个细胞核中测量染色质可及性和转录水平。经过严格的质控和过滤，研究团队成功注释了中枢神经系统的所有主要细胞类型，包括抑制性神经元(INH)、兴奋性神经元(EXC)、少突胶质细胞(OLI)、少突胶质前体细胞(OPC)、内皮细胞(END)、星形胶质细胞(AST)和小胶质细胞(MIC)。值得注意的是，抑制性神经元约占CeA神经元的75%，这与之前的神经解剖学计数结果一致。研究还进一步鉴定了细胞亚型，包括6种抑制性神经元亚型（DRD1+、LHX9+、SST+、VIP+、PENK+和FREM1+），以及少突胶质细胞、血管和免疫细胞亚型。细胞比例分析显示，AUD与对照之间没有显著的细胞比例变化。
为了开展本研究，研究人员主要运用了几项关键技术：从人死后脑组织（来源自美国匹兹堡大学医学中心脑库等）中分离细胞核并进行单核多组学测序(snMultiome-seq)，同时检测染色质可及性(ATAC-seq)和基因表达(RNA-seq)；利用生物信息学工具（如Pegasus、ArchR、Signac）进行数据质控、细胞聚类注释、差异基因表达分析（结合MAST和Wilcoxon方法）、峰值识别(MACS2)、顺式调控元件(CRMs)与基因连锁(peak-to-gene links)分析；通过chromVAR进行转录因子(Transcription Factor, TF) motif富集分析和足迹分析(footprinting)；采用连锁不平衡评分回归(Linkage Disequilibrium Score Regression, LDSC)评估GWAS信号在细胞类型中的富集情况；使用SuSiE (Sum of Single Effects)模型整合细胞类型特异性染色质可及性数据对AUD风险位点进行精细定位(fine-mapping)；并利用小鼠酒精模型对部分基因组发现进行功能验证。
系统差异基因表达揭示抑制性神经元在AUD中的脆弱性
通过对所有细胞类型簇进行差异基因表达(Differential Gene Expression, DGE)分析，研究人员发现AUD相关的差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)存在于所有细胞类型中，但绝大多数变化（769个DEGs）富集在抑制性神经元(INH)中，其中60.6%发生于INH的PENK+神经元亚型中。通过结合MAST和Wilcoxon两种分析方法，共鉴定出1,805个独特的蛋白编码AUD DEGs。基因集富集分析显示，这些DEGs显著富集于轴突导向、谷氨酸受体、细胞间信号传导等神经元通路。尤为重要的是，研究发现有19个问题性酒精使用(Problematic Alcohol Use, PAU)/AUD的GWAS风险基因在DEGs中存在显著富集，包括在INH神经元中表达发生显著变化的GRM8、GABRA2和NCAM1等基因。
AUD中钙离子活性和谷氨酸能信号基因的顺式基因调控紊乱
除了基因表达差异，研究还通过分析同一细胞核的染色质可及性，鉴定了细胞类型特异性的开放染色质峰值和顺式调控机制。共发现了789,247个峰值，其中近一半是细胞类型特异性的。通过计算峰值可及性与靶基因表达的相关性，研究确定了1,526,912个峰值-基因连锁(peak-to-gene links)，并发现92.64%的峰值表现出强烈的基因表达调控活性。研究特别强调了AUD风险基因CALN1（一个钙结合基因）的峰值-基因连锁，其在神经元细胞类型中具有高度特异性。此外，在星形胶质细胞中，也发现了与成瘾相关的基因（如NKAIN3、FGFR3）的特异性调控元件。
细胞类型特异性TF基因调控改变AUD中的GWAS和DE基因
通过分析与AUD差异表达基因对应的顺式调控元件(CRMs)中的转录因子结合motif，研究揭示了调控基因表达的上游机制。研究发现，在AUD特异的峰值中，KLF (Kruppel-like factor)家族转录因子（如KLF16）的motif存在显著富集。转录因子足迹分析显示，与对照相比，KLF16在AUD的INH神经元中结合活性更强。研究人员构建了AUD INH神经元的基因调控网络(Gene Regulatory Network, GRN)，发现KLF16与629个DEGs和64个AUD风险基因相关联。在小鼠酒精模型中的验证实验支持了KLF转录因子在调控酒精滥用相关钙离子和谷氨酸能信号通路中的功能重要性。
AUD基因调控景观中的细胞类型特异性变异精细定位
为了评估遗传风险变异在AUD脑病理中的作用，研究进行了连锁不平衡评分回归(LDSC)分析，发现AUD和PAU的GWAS信号在INH和EXC神经元中均显著富集。通过整合细胞类型特异性CRE信息与大型酒精相关GWAS的131个风险基因，研究利用SuSiE进行了精细定位，识别出223个可信的lead SNPs（候选致病单核苷酸多态性），涉及98个基因。例如，在INH神经元中，确认了神经递质释放和兴奋/抑制(E/I)平衡相关基因（如CACNA1C、SEMA6D、DRD2）的lead SNPs；在星形胶质细胞和小胶质细胞中也分别发现了AGBL2和NF1等基因的候选致病位点。
综上所述，这项研究通过对人中央杏仁核进行大规模单细胞多组学分析，构建了AUD的高分辨率分子图谱。研究结果表明，抑制性神经元，特别是PENK+亚型，是AUD病理中最易感的细胞群体。研究揭示了大量的差异表达基因和染色质调控变化，这些变化显著富集于与神经传递（特别是GABA能和谷氨酸能系统）、钙信号和免疫过程相关的通路。KLF家族转录因子（尤其是KLF16）被识别为调控AUD风险基因和差异表达基因的关键上游调节因子。通过整合遗传风险信息与表观基因组数据进行的精细定位，确认并提名了多个AUD风险位点的候选致病变异。这项工作不仅为理解AUD的细胞和分子基础提供了宝贵资源，突出了抑制性神经元在AUD病理生理中的脆弱性，而且揭示了表观遗传调控在连接遗传风险与大脑转录组改变中的重要作用，为未来开发新的治疗策略指明了方向。
