《Mycobiology》：Fungal Microbiome Within Lichen as a Potential Bioindicator of Climate Change: Insights from Transplant Field Study
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本文通过地衣移植实验，揭示了在短期气候变暖背景下，地衣内部的真菌微生物组比传统生理指标（如叶绿素含量）对温度变化更为敏感。研究发现，真菌群落的α多样性、共现网络复杂性和核心微生物组稳定性显著降低，而细菌群落则表现出更强的韧性。尤为重要的是，黑色酵母Cutaneotrichosporon debeurmannianum在高温环境中成为优势物种。该研究强调了将微生物共生体纳入评估体系的重要性，为利用地衣真菌群落结构（特别是C. debeurmannianum）作为气候变化的新型生物指示剂提供了有力证据。
摘要
全球变暖是生态变化的主要驱动因素，但其对地衣等生物指示剂的影响尚不清楚。地衣由真菌和光合伙伴（通常是绿藻或蓝细菌）共生形成，被广泛用于评估环境状况。然而，依赖传统生理指标（如叶绿素含量和光合活性）的研究对气候变化的响应报道不一。本研究假设地衣短期暴露于高温不会改变这些传统生理性状，但可能导致其相关微生物组发生变化。通过野外移植实验，将地衣暴露于更高温度的环境，并评估其生理和微生物组响应。结果显示，叶绿素含量和组织损伤在对照和升温条件之间无显著差异。相比之下，对16S和ITS区域的高通量测序揭示了微生物群落的显著变化。真菌群落表现出α多样性、共现网络复杂性和核心微生物组稳定性的显著下降。而细菌群落则表现出更强的恢复力。值得注意的是，黑色酵母Cutaneotrichosporon debeurmannianum在高温环境中成为优势物种。研究结果表明，虽然地衣的传统生理性状在短期变暖下保持稳定，但其真菌微生物组对热胁迫高度敏感。本研究确定真菌群落结构——特别是C. debeurmannianum的存在——是气候变化的一个有前景的指示剂。这些结果凸显了在评估地衣对全球变暖的生态响应时，考虑微生物共生体的重要性。
1. 引言
地衣是真菌和光合伙伴（通常是绿藻或蓝细菌）互利共生的产物。这种共生关系可能起源于约6亿年前。地衣体现了伙伴相互作用产生孤立伙伴所没有的行为和生活形式的生态系统。这些复合生物在各种生态过程中发挥着至关重要的作用，包括土壤形成、固氮以及为多种生物提供关键栖息地。地衣已适应在地球上一些最恶劣的环境中生存，从干旱的沙漠到寒冷的极地地区。地衣的共生关系能长期维持，并随时间表现出一致的形态。其缺乏角质层或气孔，便于通过整个生物体表面吸收各种污染物。因此，地衣被描述为评估周围环境的“永久控制系统”，并作为生态系统的生物指示剂被广泛研究。
在生态研究中，微生物与其宿主之间详细的相互作用已成为焦点，揭示了支配生态系统的复杂关系网络。在此背景下，微生物组在塑造多种生物的生态动态中起着关键作用。数十年的跨学科研究挑战了以狭义的、物种特异性相互作用为特征的传统地衣共生观。相反，大量证据现在表明地衣蕴藏着丰富多样的细菌和真菌群落。地衣相关细菌和真菌是栖息于地衣组织中的多样化群体。细菌居民分布在地衣叶状体的各个部分，包括皮层、髓质和藻层，不同于光合伙伴如蓝细菌或绿藻。与地衣共生中的光合伙伴不同，地衣相关细菌主要是α-变形菌。地衣中的真菌居民不同于地衣形成真菌和地衣寄生真菌，因为它们既不是地衣共生中的主要真菌伙伴，也不形成地衣叶状体的特定结构。相反，这些真菌群是特化的微生物，已进化到生活在地衣叶状体组织内部，据认为它们有助于地衣的营养循环和胁迫耐受性。
各种因素会影响地衣微生物组，包括宿主物种、宿主年龄、基质类型、地理和气候条件。这些生物和非生物因素可以塑造地衣叶状体中微生物群落的组成和多样性。
地衣的移植，无论是为了保护努力、生态恢复还是科学调查，都为探索地衣生理在新环境下的动态提供了机会。地衣移植实践可追溯到1953年进行的Peltigera实验，并出于各种目的进行。这些目标包括研究影响树皮地衣分布的因素、探索生长模式等。全球变暖的影响，是目前正在解决的一个突出问题，包括冰川退缩、珊瑚白化、海洋酸化、热浪加剧和蝴蝶的海拔迁移等。随着对这些影响的认识日益增强，地衣移植研究正积极进行，以了解地衣如何响应气温升高并作为温度制度变化的生物指示剂。已有观察表明，高温会导致地衣的稳态呼吸增加或光合性能下降，表明对其生存产生不利影响。相反，也有研究结果表明，在温度变化实验中地衣生理没有变化，表明地衣具有相对较高的耐受性和较宽的生长范围。基于此，我们假设地衣短期移植到高温环境不会改变传统的定量生理指标，但可能引起诸如地衣微生物组等不太明显的方面的变化。具体来说，我们假设短期气候变化可能不影响地衣叶绿素含量和损伤等传统指标，但可能引起地衣微生物组的结构、多样性和网络发生变化。我们研究了将本地地衣从韩国北部地区移植到较温暖的南部地区三个月的多维后果。通过这项研究，我们强调地衣微生物组是比代表地衣生理的传统指标更敏感的气候变化指示剂。
2. 材料与方法
2.1. 地衣移植实验：方法与采样策略
2022年5月18日，在韩国坡州韩国国立树木园采集了本地地衣物种Myelochroa aurulenta。随后，于2022年5月19日，将三个地衣样本移植到三个公认年均温较高的南部地点：宝城、康津和光州。根据韩国气象厅的数据，原址的年均温为11.4°C，而移植地点的年均温略高，分别为12.5°C、13.8°C和14.1°C。采集的标本被放置在尼龙丝网中。最终，于2022年8月8日，共回收了十二个独立的地衣叶状体——三个来自原址，三个来自每个移植地点——并密封在独立的自封袋中。在移植期间，原址和移植地点之间的月平均气温和月平均降水量存在显著差异。具体而言，原址记录的月平均气温和月平均降水量分别为21.8°C和292毫米，而移植地点的平均值分别为23.9°C和119毫米。样品在-80°C下保存直至进一步实验。
2.2. 利用叶绿素含量和降解水平评估地衣生理
评估了地衣健康的生理标志物，重点是叶绿素a和b含量以及降解水平作为指标。参考了Barnes等人的方案进行分析。将2.5毫克地衣材料在无光条件下于1毫升二甲基亚砜中在25°C下孵育一天。随后，提取物用新鲜二甲基亚砜按1:1稀释。叶绿素定量测定公式如下：Chl a = 14.85 A664.9- 5.14 A648.2和 Chl b = 25.48 A648.2- 7.36 A664.9。叶绿素降解使用褐藻素化商数进行评估。
2.3. 分子扩增
地衣样品经过制备，包括将片段切成1平方厘米的小块（每个叶状体三个片段），并通过用自来水冲洗，借助注射器针头去除表面残留物。使用70%乙醇和0.4%次氯酸钠的溶液对片段表面灭菌90秒。随后使用裂解珠进行匀浆，并通过PowerSoil DNA分离试剂盒促进DNA提取。使用引物515f和806r靶向细菌16S V3-V4区域进行聚合酶链式反应，这些引物连接到Illumina测序接头上。为了扩增真菌ITS1区域，使用了引物ITS1F和ITS2，方法与上述相同。每个样品使用AccuPower PCR PreMix试剂盒进行三重重复PCR扩增，条件如下：94°C初始变性5分钟，随后进行25个循环：94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸40秒，最后72°C最终延伸10分钟。在琼脂糖凝胶上评估PCR产物的质量，随后使用Expin PCR SV试剂盒进行纯化。根据Nextera XT Index试剂盒方案的建议，进行第二次条形码PCR以连接多个索引分隔符。使用NanoDrop2000测定扩增子的浓度，并将PCR产物以等分子量混合。
2.4. 高通量测序
使用Illumina MiSeq平台在Macrogen执行扩增子文库测序。原始序列通过QIIME2进行处理，包括解复用和使用DADA2流程去噪读取。细菌和真菌序列的分类学分类使用朴素贝叶斯分类器方法，分别以99%匹配率阈值对SILVA细菌数据库和UNITE真菌OTU数据库进行匹配。使用基于RAxML的q2-alignment插件进行系统发育分析。测序数据已存入国家生物技术信息中心序列读取档案库，登录号为PRJNA987839和PRJNA987843。使用‘qiime2R’将扩增子序列变异表从QIIME2导入R。过滤掉细菌的叶绿体和线粒体序列以及真菌的宿主地衣序列。使用‘phyloseq’将ASV表稀释到每个地衣宿主细菌和真菌群落分别为3,000和4,500条序列。在此过程中，细菌群落中的一个原始样本和真菌群落中的一个原始样本以及一个移植样本被排除。后续分析基于稀释后的ASV表进行。
2.5. 统计与可视化
本研究中的所有统计分析和可视化均使用R v.3.5.3进行。为了评估数据正态性，我们最初执行了Shapiro检验。由于违反了正态性假设，采用了非参数检验，包括Kruskal-Wallis检验，随后进行Bonferroni校正用于多重比较，以及Mann-Whitney U检验用于成对比较。使用‘rgdal’包可视化地衣采集和移植映射。使用‘ggplot2’和‘ggpubr’包生成说明变量统计差异的箱线图和小提琴图。使用‘phyloseq’和‘vegan’包进行基于Bray-Curtis距离的主坐标分析。使用‘ggplot2’、‘reshape2’和‘scales’包可视化微生物群落的分类学组成。通过回归分析检查微生物群落差异与温度和降水差异之间的相关性。
使用Chao1指数评估物种丰富度，使用Shannon指数评估物种多样性，从而评估微生物组Alpha多样性。使用‘seqtime’、‘SpiecEasi’和‘phyloseq’包可视化微生物群落共现网络。采用回归分析检验Alpha多样性值和网络度数与月平均气温和月平均降水量之间是否存在显著相关性。使用‘microbiome’包以0.3的流行度阈值确定核心微生物组。使用‘DESeq2’和‘EnhancedVolcano’包基于卡方检验识别移植后相对于原始状态相对丰度增加的微生物成员，标准为log2倍数变化 > 1且p < 0.05。使用‘SankeyMATIC’生成桑基图。使用‘randomForest’和‘rfUtilities’包进行随机森林分析，决策树数量设置为501。使用‘lavaan’包构建结构方程模型，潜在变量定义为气候、真菌多样性和真菌指示剂。
3. 结果
3.1. 传统地衣生理标志物在移植后保持不变
通过比较三个叶绿素相关指标：叶绿素a和b含量以及降解水平，研究了地衣健康状况是否在移植到不同气候区后发生变化。原始地衣和移植地衣之间的叶绿素a含量无显著差异。尽管移植地衣的叶绿素b含量出现了一些变化，但未观察到统计学显著性。此外，以褐藻素化商数表示的叶绿素降解程度在两组之间没有差异。总之，短期移植到较高温度并未检测到传统地衣生理标志物的变化。
3.2. 地衣微生物群落结构随气候变化而改变
观察了整体分类组成，以了解地衣移植到不同气候区域如何影响细菌微生物组。在门水平上，变形菌门占主导地位，其次是放线菌门和拟杆菌门。虽然在门或纲水平上原始地衣和移植地衣之间的分类比例没有显著差异，但移植地衣微生物群中γ-变形菌的相对丰度有所增加，其他类群的比例在两组中相似。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析二维排序显示原始地衣和移植地衣显著聚类，PERMANOVA结果证实了这一点。回归分析检验了移植地衣中细菌群落结构的差异是否与气候变化相关，揭示了群落差异性与温度差异以及降水差异之间存在显著正相关。
地衣真菌微生物群因移植而发生的变化比细菌群落更为显著。虽然在原始地衣中，子囊菌门的座囊菌纲、散囊菌纲和粪壳菌纲丰富，但移植后子囊菌门显著减少，而担子菌门的银耳纲显著增加。这种差异在基于Bray-Curtis距离的主坐标分析二维排序中很明显。此外，群落差异性与温度差异和降水差异显示出显著正相关。总之，地衣微生物组在移植后经历了群落结构的变化，并与气候变化相关，且真菌群落的变化程度比细菌群落更为显著。
3.3. 地衣真菌群Alpha多样性响应气候变化而降低
使用代表物种丰富度的Chao1指数和代表物种多样性的Shannon多样性指数测量了地衣微生物组的Alpha多样性。在细菌微生物组中，移植后Alpha多样性显示出相对较大的变异，但未观察到显著差异。与移植地点气温升高和降水减少没有显著相关性。相比之下，地衣真菌菌群在移植后表现出剧烈的Alpha多样性下降。物种丰富度和多样性均显著降低。Chao1指数与气温升高和降水减少显示出显著相关性，而Shannon多样性指数也与气候变化表现出显著相关性。总之，移植地衣中Alpha多样性出现显著下降，尤其是真菌群落与细菌群落相比。
3.4. 地衣真菌群共现网络因气候变化而减弱
通过检查网络，研究了移植到不同气候区域如何影响构成地衣微生物组的成员之间的共现模式。度代表象征每个ASV的节点之间的连通性，可视化为节点的大小。在原始地衣中，几个具有较大度的细菌居民形成了枢纽，表明存在强烈的共现模式。在移植地衣中，网络模式显著改变。除了宝城地点外，另外两个地点的总体度显著下降，尽管宝城地点的大枢纽消失了，但观察到几个度相对较小的枢纽。地衣移植后，真菌菌群发生了更剧烈的变化。在原始地衣中，存在一个大的枢纽，但移植后，真菌居民之间的共现显著减弱。
比较了地衣移植后ASV节点之间的度是否存在统计学显著差异。虽然细菌群落在移植地衣中显示出比原始地衣更大的变异，但两组之间没有统计学显著差异。然而，在真菌菌群中，移植地衣内ASV节点之间的度显著降低。通过回归分析研究了度差异是否与气候变化相关。虽然地衣细菌群落的度随着气温升高和降水减少略有下降，但差异不具统计学显著性。相比之下，真菌群落的度随着温度和降水的变化显示出相当大的变异。总之，地衣真菌群落的共现因气候变化而严重减弱。
3.5. 大多数地衣核心微生物组随气候变化而减少
核心微生物组通常代表在特定环境或生物体中常见的一组关键微生物物种。将流行度阈值设定为0.3，基于原始地衣确定了72个核心细菌ASV。属于放线菌门的细菌核心成员最丰富，其次是变形菌门和拟杆菌门。大多数细菌核心微生物组在移植后相对丰度（平均序列读数）下降，而有五个ASV显示增加。
以0.3的流行度阈值确定了75个真菌核心居民。大多数真菌核心成员属于子囊菌门，其次是担子菌门。除10个核心ASV外，其他62个ASV在移植后相对丰度下降。值得注意的是，被称为黑色酵母的fASV0001在移植后相对于原始地衣的相对丰度显著增加。总之，移植到不同气候后，地衣的细菌和真菌核心微生物组丰度主要下降，而C. debeurmannianum的相对丰度高度增加。
3.6. 黑色酵母Cutaneotrichosporon debeurmannianum成为气候变化的最有效指示剂
使用卡方检验分析了哪些微生物居民在移植地衣中相对于原始地衣显示出相对丰度增加，重点关注log2倍数变化 > 1且p < 0.05的ASV。地衣移植后，观察到48个ASV在移植后相对丰度增加。增加的细菌居民大多数属于变形菌门，其次是放线菌门。使用与细菌指示剂相同的标准，真菌指示剂在移植后增加。18个ASV在移植后增加，其中13个ASV属于子囊菌门，5个ASV属于担子菌门。最高的log2倍数变化由fASV0001展示，它是真菌核心微生物组ASV中移植后频率增加最高的。
由于真菌群落地衣移植响应比细菌更敏感，我们研究了从卡方检验结果中得出的真菌指示剂，以确定哪些菌株对整体真菌多样性施加最显著的影响，采用随机森林分析。所得模型表现出71.43%的高解释力，揭示fASV0001具有最高的平均下降精度和平均下降基尼值。正如预期，fASV0001的相对丰度在移植后急剧增加。此外，这种上升趋势与移植地点相对较高的温度和较低的降水量显示出显著相关性。通过结构方程建模，我们描绘了气候变量、真菌多样性和真菌指示剂fASV0001数量之间的相关性，具有高统计解释力。总之，气温升高和降水量减少导致黑色酵母C. debeurmannianum的优势度更高，从而导致地衣内部真菌多样性降低。
4. 讨论
近年来，随着全球变暖引发的各种有害生态变化的出现，利用指示生物来表征和预测气候变化的研究激增。地衣被认为是评估周围环境的持久监测系统，并作为生态系统的生物指示剂被广泛研究。定量生理参数如呼吸速率和光合能力已证明地衣能够响应气候变化。然而，其他研究表明地衣可能具有耐受性，表现出不那么剧烈的变化。在这项野外研究中，我们通过移植到温度较高地区的实验发现，地衣微生物组比叶绿素含量和降解水平等传统评估表现出更动态的变化。特别是在群落多样性、结构和共现网络方面，地衣的真菌微生物组对环境变化的响应比细菌居民更为敏感。这一发现提升了地衣叶状体内部真菌居民作为气候变化有效生物指示剂的突出地位。
将地衣移植到不同气候并未改变叶绿素含量或损伤程度，但动态改变了微生物组结构，表明叶状体内的微生物居民是比叶绿素更敏感的气候变化指示剂。鉴于有报道称地衣可以在黑暗环境或低温下储存数月，本研究中叶绿素的稳定性似乎是合理的。此外，本研究中的移植地点表现出比原始栖息地更高的温度和更低的降水。尽管如此，叶绿素的保存支持了先前的研究，表明地衣对水分变化（如干燥胁迫）以及温度变化具有一定的耐受性。然而，关于地衣对温度和湿度的敏感性存在相互矛盾的发现。例如，重量和长度的增加与日平均降雨量呈正相关，但与温度呈负相关，而净同化率与湿度相关。关于地衣对气候变化是敏感还是耐受的这些矛盾结果，可能源于每项研究中使用的地衣物种不同、环境变化的微气候变异等因素。在此背景下，我们的研究通过提供相对稳定的叶绿素水平和响应气候变化的动态变化的微生物组结构，提出了创新性的发现。
地衣微生物组不仅表现出物种多样性的减少，还表现出共现度和核心微生物组的减少，这些变化在真菌群落中比细菌居民更为显著。人们普遍认为气候变化可以改变物种适应性和地理分布。此外，环境温度直接影响微生物组结构。我们的研究与先前的发现一致，报告地衣内的真菌群落多样性受气候因素影响，如生长季节长度和等温性。微生物组多样性减少与宿主健康的不利影响相关，这一概念得到了来自人类肠道微生物组 accumulating evidence 的支持。热胁迫对宿主微生物组多样性的类似失调影响，可以作为全球变化下宿主健康下降的指示剂。此外，微生物组越来越被认为是其动物和植物宿主忍受热胁迫所必需的。我们强调“温度敏感性”是多方面的——生理响应、生态位、功能冗余和微生境缓冲都相互作用。因此，我们实验中未观察到大的细菌变化并不与热敏感性本身相矛盾，而是表明在特定测试条件下群落水平响应性的差异。地衣真菌菌群多样性的整体下降与真菌指示剂黑色酵母Cutaneotrichosporon debeurmannianum优势度增加密切相关，正如结构方程模型所揭示的那样。地衣中的真菌群落包括主要菌根真菌以外的广泛类群，最近的元条形码调查经常在内生微生物群中发现担子菌酵母。虽然关于地衣中C. debeurmannianum的明确报道仍然有限，但Cutaneotrichosporon和毛孢子菌科的相关类群已在来自多个地理区域的研究中被观察到，表明此类酵母可能与地衣宿主形成 recurrent but understudied associations。C. debeurmannianum是一种医学相关物种，已知包括深部和浅表感染的病原体，如白色毛结节菌和糖尿病足感染。虽然已知C. debeurmannianum在L-DOPA存在下产生黑色素样颗粒，但其在地衣内的作用很大程度上未知。担子菌酵母已知与特定地衣物种在广阔的地理距离上保持密切联系。因此，C. debeurmannianum被推测作为核心真菌菌群成员发挥重要的生态作用，建议后续对该黑色酵母进行生理和分子研究。
我们通过移植实验进行的研究有助于基础理解微生物对气候变化的反馈。然而，它有几个局限性。首先，承认对环境数据的控制不完美。虽然地衣被移植到平均温度较高的地区，但除了温度和降水之外，可能有几个变量与原址不同。这个限制可以通过在实验室环境中更精确地控制变量来解决。其次，我们没有通过功能分析阐明地衣微生物组的生态位。地衣微生物组在叶状体内执行的实际生态作用很大程度上未知，并且大多是推测性的。我们预计，正在进行的研究，包括宏基因组学和转录组学研究，将逐步解决这一好奇心。最后，我们承认移植设计并未完全将气候效应与地点特定因素分开。然而，所有移植地点一致表现出比原址更高的平均年温度，并且微生物群落响应在不同地点显示出一致的定向模式。这表明温度相关因素可能促成了观察到的变化，尽管不能完全排除地点效应。虽然气候变化发生在长时间尺度上，但短期移植和变暖实验通常用于检测微生物对温度变化的早期响应。此类响应可能先于长期的群落重组，从而为对变暖特别敏感的类群提供见解。因此，我们的结果应被解释为早期阶段响应，而不是长期气候驱动动态的预测。尽管存在这些局限性，我们的研究是有价值的，因为它提供了关于地衣微生物组群落聚集如何响应气候变化的见解。我们相信，我们结合地衣移植和微生物组分析的方法，不仅可以应用于温度变化，还可以应用于各种情况，包括暴露于重金属等有害物质以及光照条件的变化，为研究开辟了新视野。
