基于抗原和抗体特异性结合的免疫测定已成为体外检测的强大工具。由于其高通量、简单性和成本效益，免疫测定被广泛应用于临床诊断[1]、食品安全监测[2]和环境监测[3]等领域。近年来，纳米技术的快速发展促进了纳米颗粒（NPs）在免疫测定中的集成[4],[5],[6],[7]，因为它们具有高比表面积、强可修饰性和优异的生物相容性。目前，各种功能性NPs（如胶体金[8],[9]、磁性纳米颗粒[10]、量子点[11],[12]、聚集诱导发光颗粒[13]、纳米酶[14],[15]和上转换纳米颗粒[16],[17]）已成功应用于免疫测定设计中。它们通常作为抗体载体、信号放大器或与抗体结合的信号输出/转换器，形成抗体-NPs偶联物，成为检测系统的重要组成部分，显著提升了分析性能。
在基于纳米颗粒的免疫测定（NPIAs）中，抗体-NP偶联策略直接决定了测定性能，因为它直接影响偶联效率、抗体功能和均匀性。传统的NPIA平台通常采用三种偶联方法之一：物理吸附[9]、化学偶联[18],[19]和通过二次抗体[20],[21]或链霉亲和素-生物素[22]介导的捕获方法。然而，物理吸附通常偶联效率低且稳定性差。化学偶联方法虽然广泛应用，但可能导致结构破坏和抗体取向随机，从而影响功能[23],[24]。尽管二次抗体捕获方法可以改善取向控制，但它涉及多个步骤，存在显著的空间位阻，并且成本较高，限制了其实际应用。因此，迫切需要一种满足以下关键性能标准的先进偶联策略：(i) 高偶联效率；(ii) 优异的复合物稳定性；(iii) 最大限度地保持抗体结合活性；(iv) 高批次间均匀性。
NPIA性能的另一个关键因素是抗体价态，它来源于每个NPs上展示的功能性抗体分子的数量。抗体-NP偶联物的一个关键特征是其多价性，即单个NPs上呈现多个抗体拷贝。重要的是，目标分子的结合不仅取决于单个抗原-抗体对的亲和力，还取决于多价相互作用产生的整体表观亲和力。因此，利用多价性已成为增强结合亲和力的强大策略[25],[26]，从而优化免疫测定的实际应用功能。在靶向药物输送和成像领域，通过利用NPs的多价相互作用来最大化其亲和力和目标特异性同时最小化不良免疫反应方面取得了显著进展[27],[28],[29],[30],[31]。然而，对于NPIAs，尚未有研究阐明抗体价态如何影响测定性能。这是一个明显的局限性，因为能够精确关联抗体价态与测定性能将有助于优化免疫测定的合理设计。
为了研究抗体偶联策略和价态对免疫测定性能的影响，需要一个简单、直观的模型系统，并且该系统因价态变化而表现出明确的信号变化。光化学诱导的均相化学发光免疫测定（HCLIA）是一种已被广泛开发和应用于检测多种目标的方法，包括抗生素[20],[21]、毒素[32],[33]、病原体[19],[34]和疾病生物标志物[18],[35]。在检测小分子时，HCLIA系统包括抗体偶联的受体珠（抗体-ABs）和半抗原偶联的供体珠（半抗原-DBs）。该技术依赖于半抗原-DBs和抗体-ABs之间的能量转移，这种转移由抗原-半抗原相互作用触发，产生发光信号。重要的是，信号强度本质上对价态依赖的结合相互作用敏感，确保抗体价态的变化直接影响测定性能。因此，HCLIA是探索抗体价态、结合亲和力和测定性能之间相互作用的理想模型系统。
喹诺酮类（QNs）是一类广谱抗生素。由于它们在畜牧业和水产养殖中的广泛使用，其在动物源性产品（特别是牛奶[36],[37]）中的残留问题引起了严重的食品安全担忧。在我们之前的工作中，制备了一种能够识别17种QNs的广谱单链可变片段（scFvC4A9H1）[38]。在本研究中，我们选择这种scFv及其QN目标作为模型抗原-抗体对。提出并应用了一种位点特异性偶联策略，以实现scFv在NPs上的定向和定量偶联。然后，我们系统地阐明了价态对HCLIA系统中测定灵敏度和稳健性的影响。此外，我们使用表面等离子体共振（SPR）技术定量分析了scFv价态与两种纳米颗粒群体相互作用中的结合亲和力之间的关系。最终，开发并验证了一种用于检测牛奶中17种QNs的优化HCLIA方法（图1），表现出优异的分析性能。
