《Aquatic Toxicology》：Chemical induction of settlement and metamorphosis in larvae of Manila clam
Ruditapes philippinarum
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本研究系统评估了神经化学诱导剂（5-HT、L-DOPA等）和无机离子（K?、Ca2?等）对马氏贝幼虫附着及变态的影响。结果表明，5-HT在10?2-1 μM范围内显著促进附着（>65%），但高浓度（102 μM）导致急性毒性；L-DOPA在10 μM时短暂有效（66.3%）；K?（30 mM）和Ca2?（30-50 mM）提升附着率（41%和51%）但高浓度增加死亡率（≥37.7%）。NH4?和Mg2?无明显效应。研究为贝类人工育苗提供了关键阈值指导。
王家康|崔志阳|李华旺|陈彦翠|吴彪|周丽青|刘志宏|马培珍|李传传|孙秀军
中国渔业科学院黄海渔业研究所海洋养殖生物育种与可持续产品国家重点实验室，中国青岛
摘要
幼虫的附着和变态是控制双壳类动物补充和种群动态的关键生物学过程，对水产养殖的可持续性具有深远影响。本研究系统评估了神经化学诱导剂（5-羟色胺[5-HT]、L-多巴、乙酰胆碱、胆碱）和无机离子（K?、Ca2?、NH??、Mg2?）对菲律宾蛤Ruditapes philippinarum幼虫附着和变态的影响。实验室生物测定表明，5-羟色胺在10?2至1 μM的浓度范围内，在6-24小时内可诱导超过65%的附着和变态。然而，在102 μM的浓度下表现出急性毒性，72小时后导致100%的死亡率。相比之下，L-多巴在10 μM时表现出短暂的效果，在6小时内可实现66.3%的附着和变态，但在48小时后不再具有诱导作用。在离子中，K?（30 mM）和Ca2?（30-50 mM）显著增强了幼虫的附着和变态，24小时时的诱导率分别为41%和51%，但高浓度会导致幼虫死亡率增加（≥37.7%）。氯化铵（通常以离子化和更具毒性的非离子化形式存在，部分取决于pH值）表现出强烈的毒性，在20 mM以上浓度下48小时内导致100%的死亡率，而Mg2?对附着和存活率几乎没有影响。这些发现突显了化学信号对R.philippinarum幼虫附着和变态的诱导作用，为优化水产养殖中的孵化场饲养方案提供了实际阈值（例如，1 μM 5-羟色胺，暴露时间≤24小时）。
引言
浮游幼虫的附着和变态是海洋底栖无脊椎动物生命周期中的关键生态和发育转变阶段，包括软体动物双壳类。这一阶段不仅是个体生存的瓶颈，也是底栖种群补充、基因流动和物种在异质海洋栖息地中分布的关键决定因素（Pawlik, 1992; Pechenik, 1999; Hadfield, 2000）。这一阶段的成功补充直接影响底栖生态系统的恢复力和水产养殖物种的生产力。在这个复杂且不可逆的变态过程中，幼虫从移动的浮游状态转变为固着或半固着的底栖幼体，经历快速的形态和生理重塑。这些变化包括外套膜的吸收、鳃和足的发育、消化系统的重构以及神经系统和免疫系统的调节，所有这些都由严格调控的神经内分泌信号级联和环境响应的基因表达程序协调（Crisp, 1974; Hadfield et al., 2001; Joyce and Vogeler, 2018; Sun et al., 2024）。越来越多的证据表明，幼虫的附着和变态受到环境刺激与内部生理准备（即能力）之间复杂相互作用的影响，包括外在因素（生物和非生物）和内在调节因子（激素和遗传）。关键的外源信号包括微生物生物膜、基质地形、光梯度、水动力以及化学信号（例如溶解的氨基酸、金属离子和神经活性化合物，如先前研究所述（Fitt et al., 1990; Rodriguez et al., 1993; Ganesan et al., 2012）。在这些信号中，神经化学诱导剂，特别是儿茶酚胺（如多巴胺、去甲肾上腺素）、吲哚胺（如5-羟色胺）及其代谢前体（如L-多巴和色氨酸），在激活启动附着行为的信号转导途径和软体动物的形态发生中起着关键作用（Coon and Bonar, 1986; García-Lavandeira et al., 2005; Yang et al., 2013）。这些神经递质与G蛋白偶联受体（GPCRs）结合，触发细胞内第二信使（包括环腺苷酸[cAMP]、钙离子[Ca2?]和蛋白激酶）的激活，从而调节下游的发育基因和形态发生效应器（Bonar et al., 1990; Liang et al., 2016）。此外，最近的研究表明，这些信号网络表现出物种特异性和时间敏感性，强调了不同软体动物谱系在幼虫变态调节上的进化差异（Beiras and Widdows, 1995; Sun et al., 2014; Joyce and Vogeler, 2018）。例如，尽管神经递质（多巴胺和L-多巴）已被证明在多种双壳类物种中具有诱导变态的作用，但它们在受体介导的信号传导或发育敏感性方面存在种间差异（Urrutia et al., 2004）。相比之下，已知调节膜去极化和细胞兴奋性的金属离子（如钾[K?]和镁[Mg2?]在软体动物的幼虫附着和变态中显示出有希望的诱导作用（Liu et al., 1998; Yang et al., 2015）。尽管如此，大多数双壳类物种中关于化学诱导剂和幼虫附着及变态诱导机制的全面解释仍然有限。
菲律宾蛤Ruditapes philippinarum是一种广泛分布于东亚沿海地区的双壳类物种，是全球水产养殖中最重要的软体动物之一（FAO, 2024）。这主要是由于其美味的风味、低成本和消费者的强烈偏好。它生长迅速，并具有很强的环境适应性。在中国，它属于四大主要传统养殖贝类之一，在保障食品安全、维持农村生计和促进可持续沿海经济发展方面发挥着关键作用。除了经济价值外，R. philippinarum还在当地沿海水域中作为重要的滤食性生物，有助于营养循环和维持底栖生态系统的平衡。与其他底栖双壳类动物类似，R. philippinarum经历了一个双相生命周期，其特征是从浮游幼虫阶段过渡到依赖基质的附着和变态（Wu et al., 2022）。在具有附着能力的面盘幼虫阶段，幼虫表现出明显的基质选择性行为，并根据环境信号启动形态发生转变。这些信号包括微生物生物膜、同种贝壳物质、化学诱导剂和离子梯度，共同决定了幼虫附着和变态的成功（Hadfield et al., 2001; García-Lavandeira et al., 2005）。然而，在人工苗种培育过程中，常见的问题包括低附着和变态率以及幼虫存活率低。这些挑战导致单位水体体积的幼虫产量波动较大，苗种供应不稳定，直接削弱了农民的经济回报（Gao et al., 2024）。因此，探索有效的化学信号以诱导R. philippinarum的幼虫附着和变态尤为重要。
为研究化学信号对R. philippinarum幼虫附着和变态的诱导作用，本研究系统评估了四种阳离子（K?、Ca2?、NH??、Mg2?）和四种神经活性化合物（5-HT、L-多巴、乙酰胆碱、胆碱）。我们进行了浓度梯度生物测定，以确定多个时间点的最佳诱导阈值以及潜在的毒性效应。这些发现不仅为幼虫附着和变态提供了重要的科学基础，还将为提高蛤类孵化场商业苗种生产的成功率提供指导。
部分摘要
产卵和孵化
实验在中国福建省中岭农业发展有限公司进行（25.2775°N, 118.9577°E）。选择来自广东省的性成熟的R. philippinarum亲本进行产卵诱导。根据先前的研究（Wang et al., 2008），成熟的个体经过遮荫干燥和静水刺激来诱导产卵。24小时后，收集发育到D阶段的幼虫并转移到饲养池中幼虫对不同离子的反应
Mg2?对幼虫的附着和变态具有弱的诱导作用。大多数测试浓度（10、30、40和50 mM）在任何观察时间点都没有显著增强附着（图1A）。唯一的例外是20 mM处理，在48小时时显著增加了附着和变态率（P < 0.05，图1A）。确定Mg2?在≥30 mM的浓度下对幼虫具有毒性，表现为显著离子特异性诱导：比较效果和适应性权衡
48小时时，菲律宾蛤幼虫附着的最佳K?浓度为30 mM，成功率为41%，而对照组约为27%。相比之下，Mytilus edulis需要更高的50 mM浓度来诱导附着（Yang et al., 2013），而Haliotis discus hannai对较低的10 mM浓度有反应（Kang et al., 2004）。苔藓虫Bugula neritina在20 mM K+下几乎完全变态（Wendt and Woollacott, 1995），而结论
本研究系统地研究了多种化学物质（包括神经递质、金属离子和氨）对
R. philippinarum幼虫附着的诱导作用，评估了它们的效果和毒性阈值。5-羟色胺在低浓度（10
?2至1 μM）下显著增强了附着（>65%），但在较高剂量下具有毒性。相反，L-多巴表现出短暂的、时间依赖的附着反应，随着化合物的降解而减弱。对无机离子的研究
作者贡献
孙秀军构思了该项目并设计了实验。王家康、孙秀军、周丽青进行了实验。王家康、崔志阳和李华旺固定并收集了幼虫样本。王家康和陈彦翠分析了数据。王家康撰写了手稿。吴彪、周丽青、马培珍、刘志宏和李传传进行了修订。所有作者都阅读并批准了最终的手稿发表。伦理批准
作者确认所有实验均按照相关指南和规定进行。缩写
5-HT：盐酸5-羟色胺；L-DOPA：3,4-二羟基-L-苯丙氨酸；胆碱：氯化胆碱；乙酰胆碱：氯化乙酰胆碱。未引用的参考文献
Coon et al., 1990b, Dickinson and Croll, 2003, Joyce and Vogeler, 2018, Beiras and Widdows, 1995, Le et al., 2017, Liu et al., 2016b, Pechenik et al., 2002, Sun et al., 2014, Voronezhskaya et al., 2008, Yang et al., 2008, Yang et al., 2015bCRediT作者贡献声明
王家康：撰写——原始草稿，项目管理，正式分析，数据管理。崔志阳：方法学。李华旺：方法学。陈彦翠：验证，资源，数据管理。吴彪：项目管理，概念化。周丽青：监督。刘志宏：数据管理。马培珍：项目管理。李传传：验证，资源，调查，数据管理。孙秀军：验证，监督，项目管理，调查，资金支持
