综述：基于显微成像系统的活体NIR-II荧光成像：探针、系统及其生物成像与分析应用

《Coordination Chemistry Reviews》：In vivo NIR-II fluorescence imaging based on microscopy set-ups: probes, set-ups, bioimaging and bioanalysis applications

本综述系统阐述了基于显微系统的第二近红外窗口（NIR-II）活体荧光成像技术，聚焦于高性能荧光探针（如量子点、稀土纳米颗粒）与显微系统（宽场、共聚焦、光片）的协同发展。文章深入探讨了如何通过优化探针光学特性与成像系统设计，实现在细胞水平的高对比度、高信背比（SBR）深层活体成像，并展望了该技术从“技术驱动”向“科学驱动”转化的挑战与机遇。

　　

基于显微成像系统的NIR-II荧光成像技术概览

引言

活体荧光成像（FLI）凭借其高灵敏度、快速响应和实时监测能力，已成为诊疗一体化应用的重要平台。与传统可见光（400–700 nm）和第一近红外窗口（NIR-I, 700–900 nm）成像相比，在重新定义的第二近红外窗口（NIR-II, 1000–2300 nm）内操作的荧光成像展现出显著优势，包括更深的组织穿透深度和更高的信背比（SBR）。这些优势源于NIR-II光谱区域内光子散射的减少和组织自发荧光的最大化抑制。

尽管宏观NIR-II成像在毫米至厘米尺度的视野（FOV）内对肿瘤、炎症及脑血管疾病等病理状况的检测显示出显著成效，但许多疾病源于细胞尺度，传统宏观成像缺乏解析精细形态和结构细节所需的分辨率。光学显微镜以其小视野（通常<1 mm）和高空间分辨率（常规<200 nm）成为解析特定生物分子存在、空间组织和形态的重要工具。2017年，Dai及其同事首次将共聚焦显微镜技术延伸至NIR-II区域，利用IR-FGP荧光团（λ_abs/λ_em= 745/1050 nm）对170 μm厚的脑组织切片进行了高对比度成像，揭示了NIR-II共聚焦显微镜在增强穿透深度方面进行组织成像的潜力。

NIR-II荧光探针与显微系统的协同发展

NIR-II FLI MS技术的两大核心组成部分——NIR-II荧光探针和NIR-II显微成像系统——相互补充、协同平衡，共同推动着活体细胞水平NIR-II FLI MS的发展。

NIR-II荧光探针的进展与显微系统的革新齐头并进。为实现高性能活体成像，探针需具备高亮度、良好生物相容性及靶向性。目前已开发的探针种类包括分子荧光团、下转换纳米颗粒（DSNPs）、量子点（QDs）、金属纳米团簇、蛋白质和单壁碳纳米管（SWCNTs）等。例如，发射波长在1700 nm的PbS/CdS量子点与NIR-II光片显微镜（LSM）结合，实现了活体哺乳动物深层组织的非侵入性三维光学成像；新型NIR-II聚集诱导发光（AIE）点与基于时间相关单光子计数（TCSPC）的共聚焦NIR-II荧光寿命成像平台结合，实现了小鼠脑血管网络的精细可视化。

在显微系统方面，宽场、共聚焦和光片（LSM）是三种主要模态。每种系统对探针有其特定要求。共聚焦显微镜通过空间滤波提升分辨率，适用于高分辨率静态成像；光片显微镜则通过平面照明和正交检测，极大减少了光毒性和光漂白，非常适合长时间、大体积的活体动态观测；宽场显微镜则以其简单快速的特点，适用于某些快速筛查场景。

NIR-II FLI MS的活体应用

随着NIR-II荧光探针和显微技术的快速发展，其活体应用也日益多样化。目前，NIR-II FLI MS主要集中于细胞成像、血管成像和组织三维重建成像。

在细胞成像方面，该技术能够实时追踪脑癌细胞转移、中性粒细胞跨血管内皮渗出的级联事件等动态生理过程。在血管成像领域，通过整合临床批准的染料吲哚菁绿（ICG）与定制的NIR-II共聚焦显微镜，实现了对非人灵长类动物（恒河猴）大脑皮层血管的活体成像，这是向临床转化迈出的关键一步。在组织三维成像方面，双通道NIR-IIb（1500–1700 nm）荧光成像系统结合发射1632 nm的立方相稀土下转换纳米颗粒（α-TmNPs），能够进行同步双通道动态成像，便于复杂的生理观测。

挑战与机遇

尽管NIR-II FLI MS技术前景广阔，但仍面临诸多挑战。在探针方面，需要进一步开发兼具高量子产率、良好生物安全性和特异靶向能力的新型探针。在仪器方面，需要提高成像速度、深度和分辨率，并降低成本以促进广泛应用。此外，如何将获取的海量成像数据转化为有价值的生物学见解，也需要强大的生物信息学工具。未来，通过跨学科合作，深入探索探针与生物体系的相互作用，优化成像系统设计，有望推动NIR-II FLI MS从“技术驱动”向“科学驱动”转变，在生命科学和医学研究领域发挥更大作用。

结论

NIR-II FLI MS利用NIR-II窗口内组织散射（μ_s’）和吸收（μ_a）系数降低的优势，实现了比传统NIR-II宏观成像更高的对比度和更深的组织穿透能力。这使得实时荧光追踪以往难以观察的生命过程成为可能，例如免疫细胞在淋巴组织内的迁移、定位和细胞间相互作用。通过持续优化探针性能和成像系统，NIR-II FLI MS有望在生物医学研究和临床诊断中开辟更多新的应用途径。