《Haematologica》：Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of mucosa-associated invariant T cells in donor grafts and its diagnostic relevance in gastrointestinal graft-
versus-host disease
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本研究针对异基因造血干细胞移植后胃肠道移植物抗宿主病（gut aGVHD）防治难题，通过单细胞RNA测序技术深入探讨了粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导的黏膜相关恒定T（MAIT）细胞功能特性。研究发现G-CSF通过CSF3R受体增强MAIT细胞的免疫抑制和组织修复功能，并揭示CXCR6-CXCL16轴介导的肠道归巢机制。基于此开发的流式细胞术预测模型可将aGVHD预测干预前移至移植前阶段，为临床实践提供了新策略。
在血液恶性肿瘤的治疗领域，异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）作为一项关键治疗手段，却始终面临着移植物抗宿主病（GVHD）这一严峻挑战。其中，胃肠道急性移植物抗宿主病（gut aGVHD）尤为棘手，它常常导致移植失败，严重影响着患者的生存质量与总体生存率。传统上，移植后发生的aGVHD往往难以预测和早期干预，科学家们一直在寻找能够在移植前就有效评估风险的方法。
以往的研究发现，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）在动员造血干细胞的同时，对移植物的免疫细胞组成具有重要的调节作用，能够诱导T细胞耐受，从而有助于预防GVHD。特别值得注意的是，移植物中一种名为黏膜相关恒定T（MAIT）细胞的数量，似乎与较低的肠道aGVHD发生率相关。MAIT细胞是一类先天样T细胞，在人体血液和黏膜组织（如肠道）中含量丰富，它们既能发挥常规的效应功能，又具备组织修复的能力，在维持黏膜屏障完整性方面扮演着关键角色。然而，G-CSF动员究竟如何影响MAIT细胞的功能，以及这些细胞是如何迁移到肠道并发挥保护作用的，其具体机制尚不清晰，这限制了将其转化为临床应用的可能。
为了解开这些谜团，一项发表在《Haematologica》上的研究应运而生。研究人员综合运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、体外功能实验以及小鼠体内模型等多种先进技术手段。他们首先从健康捐献者动员前后采集外周血样本分离MAIT细胞进行单细胞测序，揭示了G-CSF诱导后MAIT细胞的转录组变化；通过体外共培养实验验证其功能改变；并利用人源化NSG小鼠模型模拟移植后过程，观察MAIT细胞的体内动态分布；最后，在一个临床移植队列中，基于流式细胞术分析开发了预测模型。
研究结果显示，G-CSF动员并没有显著改变外周血中MAIT细胞的频率，但却深刻地改变了其功能状态。单细胞测序分析发现，G-CSF诱导的MAIT（G-MAIT）细胞展现出向免疫抑制和组织修复功能特征的转录偏移。特别是一个高表达G-CSF受体CSF3R（其蛋白产物为CD114）的细胞亚群（簇12）被识别出来，该亚群表现出更强的免疫抑制和组织修复相关基因特征。机制上，G-CSF通过与MAIT细胞表面的CSF3R结合，直接上调了如ZFP36、DUSP2等免疫调节相关基因的表达。体外实验证实，G-MAIT细胞对CD4+T细胞增殖的抑制能力显著增强。
更重要的是，研究发现G-MAIT细胞要发挥保护作用，必须能够有效地迁移到肠道组织。scRNA-seq和流式细胞术分析均表明，趋化因子受体CXCR6的表达在未发生肠道aGVHD的捐献者来源的G-MAIT细胞中更高。在小鼠模型中，通过抗体阻断CXCR6的配体CXCL16，确实导致了G-MAIT细胞向肠道募集的减少，并加重了肠道GVHD的病理表现。这证明CXCR6-CXCL16轴是G-MAIT细胞肠道归巢的关键机制。
基于这些发现，研究团队创新性地构建了一个包含MAIT细胞频率及其功能标志物（CD114、IL-17A、IL-4、CXCR6）表达水平的综合预测评分系统。在80例G-CSF动员的外周血干细胞（G-PBSC）移植临床队列中验证，该评分能有效区分出肠道aGVHD的高危人群，其预测效能显著优于单独使用MAIT细胞频率，为实现移植前的个体化风险预测和早期干预提供了实用的工具。
Granulocyte colony-stimulating factor induces MAIT cells to enhance immunosuppression and tissue repair
研究人员首先通过流式细胞术评估了G-CSF对MAIT细胞的影响。发现G-CSF动员后，MAIT细胞中白细胞介素4（IL-4）的表达显著增加，表明其向Th2型极化，增强了免疫耐受倾向。单细胞RNA测序进一步将MAIT细胞分为14个功能异质性簇。G-MAIT细胞显示出免疫抑制和组织修复基因特征的增强，同时细胞毒性特征减弱。体外抑制实验证实，G-MAIT细胞对CD4+T细胞增殖的抑制能力更强。
G-CSF-CSF3R interaction mediates the functions of MAIT cells
差异表达基因分析显示，G-CSF动员后，MAIT细胞中与免疫抑制、Th2发育、IL-17信号以及组织驻留相关的基因上调。其中，高表达CSF3R的簇12在G-CSF动员后比例和G-CSF评分均显著增加，且该簇表现出最强的免疫抑制特征。基因集富集分析提示该簇与组织修复相关通路富集，且GVHD相关通路下调。流式细胞术验证了CD114+MAIT亚群在G-CSF动员后扩增，并且在临床队列中，发生肠道aGVHD的患者其捐献者G-MAIT细胞的CD114表达显著更低。
Functional heterogeneity of G-MAIT cells correlates with gut acute graft-versus-host disease outcomes
根据移植后是否发生肠道aGVHD对样本进行分层分析发现，未发生肠道aGVHD组的捐献者来源G-MAIT细胞，其CSF3R及靶基因、免疫抑制、组织修复、迁移和组织驻留相关基因的表达均更高。流式验证也确认了该组G-MAIT细胞的IL-4和IL-17A表达更高。此外，未发生肠道aGVHD组的G-MAIT细胞其趋化因子信号通路和相关受体（如CXCR6、CCR7）表达更活跃，提示其迁移能力更强。
G-MAIT cells exhibit gut-specific chemotaxis and anti-gut acute graft-versus-host disease effects in vivo
在NSG小鼠模型中发现，随着GVHD进展，MAIT细胞在肠道组织中的富集程度高于外周血和骨髓。并且，GVHD评分较低的小鼠，其肠道内MAIT细胞浸润更多，表明MAIT细胞向肠道的特异性迁移与其保护作用相关。
CXCR6 is required for G-MAIT cell recruitment to gut tissue
鉴于CXCR6在未发生肠道aGVHD组中表达差异显著，研究聚焦于其功能。在NSG小鼠中使用抗CXCL16抗体阻断CXCR6-CXCL16相互作用后，肠道内MAIT细胞的募集明显减少，而其他组织受影响小，同时小鼠表现出更严重的GVHD症状和肠道病理损伤。免疫荧光进一步证实阻断后肠道内CD3+CD161+CD4-CD8-T细胞（主要为MAIT细胞）的频率和密度显著降低。
A predictive MAIT cell-based panel for gut acute graft-versus-host disease
基于上述发现，研究整合了CSF3R、IL17A、IL4、CXCR6这一基因集，并在临床队列中开发了一个综合MAIT细胞频率和CD114、IL-17A、IL-4、CXCR6表达水平的流式细胞术预测评分。该评分在预测肠道aGVHD方面表现出高灵敏度和特异性（75%和93%），且多因素分析表明低评分是肠道aGVHD的独立预测因素。该模型优于仅使用MAIT细胞频率的预测方法。
综上所述，本研究首次在单细胞分辨率下系统阐述了G-CSF如何通过CSF3R信号通路重塑MAIT细胞的功能状态，使其获得更强的免疫调节和组织修复潜能，并揭示了CXCR6-CXCL16轴在介导这些功能性MAIT细胞肠道归巢中的关键作用。这不仅深化了对MAIT细胞在移植免疫中功能的理解，更重要的是，所开发的基于移植前供者移植物MAIT细胞特征的预测模型，将aGVHD的预测和干预窗口显著前移，为临床实现个体化的GVHD防治策略提供了新的思路和具有高度转化潜力的工具。
