《Chemical Engineering Journal》：Emerging methods to improve PROTAC transport across cell membrane
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PROTACs通过泛素化-蛋白酶体系统降解靶蛋白，面临细胞渗透性差等挑战，现有递送策略包括抗体-PROTAC偶联、细胞穿透肽、纳米颗粒及电穿孔等方法，需结合目标蛋白特性优化设计。
Fatemeh Veisi | Farangis Ataei
伊朗德黑兰塔比亚特莫达雷斯大学生物科学学院生物化学系
摘要
靶向蛋白水解的嵌合体（PROTACs）是一种通过泛素-蛋白酶体系统选择性地消除细胞内目标蛋白的策略。这些是经过工程改造的异源双功能分子，具有两个共价连接的配体，能够将E3泛素连接酶和目标蛋白（POI）拉近，从而导致POI的泛素化及随后的蛋白酶体降解。通过有效消除POI而不影响其他蛋白质，PROTACs可以产生持久的治疗效果并克服药物耐药性。尽管具有许多优势，PROTACs仍面临一些限制，尤其是细胞渗透性较差的问题。不同的PROTAC平台利用不同的机制来实现目标蛋白的清除。本文旨在概述目前可用的PROTACs细胞内转运方法，以确定未来的研究方向。PROTACs可以通过与抗体（抗体-PROTAC缀合物）或适配体（基于核酸的递送系统）结合进入细胞；这些方法的选择性使其能够准确识别目标蛋白并促进PROTAC的递送。或者，PROTACs可以连接到纳米粒子的表面或内部，或者通过电穿孔等途径进入外泌体，再通过内吞作用或膜融合进入细胞。此外，有时还会在PROTAC上添加细胞穿透肽（CPPs）以直接穿过细胞膜。此外，如CLIPTAC这样的化学反应也可以帮助它们进入细胞。每种方法都有其优缺点；因此，PROTAC的最佳设计策略取决于具体目标和目标蛋白的特性。
引言
靶向蛋白水解的嵌合体（PROTAC）是一种利用泛素-蛋白酶体系统进行目标蛋白降解的先进技术。PROTACs是由三部分组成的异源双功能分子：目标蛋白（POI）、E3连接酶招募元件和连接子[1]、[2]、[3]、[4]。PROTAC可以结合POI配体和E3连接酶，促进两者之间的接近，并通过招募E3连接酶来促进POI的泛素化[3]、[5]、[6]、[7]。PROTACs介导POI-PROTAC-E3三元复合物的形成，从而使POI被泛素化并随后被蛋白酶体复合物降解，如图1所示[1]、[2]、[4]、[8]。
泛素（Ub）是一种保守的76个氨基酸的多肽，通常通过三个步骤附着在底物的赖氨酸残基上。首先，泛素通过硫酯键与泛素激活酶（E1）结合，利用ATP作为媒介。然后，活化的泛素与泛素结合酶（E2）活性位点上的半胱氨酸结合[9]、[10]。在E3泛素连接酶的存在下，泛素多肽通过异肽键从E2的半胱氨酸转移到底物（POI）的赖氨酸上。接下来，带有多聚泛素的POI被26S蛋白酶体19S调节颗粒上的泛素受体识别，转移到圆柱形核心并经过不同酶的作用被水解[10]、[11]。
PROTAC技术最早由Sakamoto等人于2001年报道，他们发现甲硫氨酸氨基肽酶-2（MetAP-2）是SCFβ-TRCP E3连接酶的靶标[12]。PROTAC不应抑制POI，且与POI的结合应该是可逆的，这样一份PROTAC就可以降解多个POI分子。一旦目标蛋白通过泛素标记被标记为降解对象，PROTAC可以从一个目标蛋白上脱离，然后多次结合到另一个相同的靶标上，因此低剂量的PROTAC就可以发挥作用[13]、[14]。PROTACs具有靶向不同蛋白的能力，并能降解难以用小分子抑制剂处理的靶标，因此在治疗多种疾病（包括癌症、神经退行性疾病和代谢紊乱）方面具有巨大潜力[15]、[16]、[17]。除了细胞内蛋白外，PROTACs还可以用于降解细胞外和膜结合的蛋白[8]、[18]。
PROTACs相比小分子抑制剂具有优势。小分子抑制剂通过占据目标位点与蛋白结合，但随着时间的推移，由于蛋白质目标位点的突变和变化，可能会产生耐药性[2]、[19]、[20]。小分子抑制剂与目标蛋白的结合亲和力是一个关键参数，它们需要结合更多的目标蛋白并且需要更高的剂量[21]、[22]。然而，PROTAC的功能不依赖于与POI的结合亲和力，即使结合亲和力较低也能破坏POI[13]、[22]、[23]。另一方面，PROTACs与目标蛋白的结合不是长期高强度的，且可以在较低浓度下使用，同时副作用也更小[12]、[15]、[24]。
值得注意的是，PROTACs与传统的小分子抑制剂相比存在一些挑战，包括水溶性差、肿瘤特异性低、极性表面高以及分子量大，难以穿过细胞膜中的磷脂双层[24]、[25]。在某些情况下，高浓度的PROTACs会在细胞内积累而不是形成三元复合物（所谓的“钩效应”），从而阻碍目标蛋白的降解[6]、[26]、[27]。此外，PROTAC对目标蛋白的有效降解可能会对正常细胞或器官造成意外损伤[11]、[24]。水溶性低会降低生物利用度，而使用存在于健康组织和肿瘤组织中的E3连接酶可能会产生副作用[5]、[28]。此外，肿瘤细胞可以通过突变E3连接酶的结合位点或降低E3连接酶的表达水平来对抗PROTAC[29]、[30]。大多数PROTACs被设计用于靶向细胞质蛋白[31]，只有少数PROTACs被开发用于靶向膜蛋白[32]或聚集蛋白[5]、[33]。此外，肿瘤细胞与其细胞外基质之间的粘附性阻碍了药物和PROTAC的细胞间转移。在肿瘤进展过程中，细胞外基质化合物（如胶原蛋白和纤维连接蛋白）的过度产生会形成紧密的网络，降低抗癌药物和PROTAC的渗透性[34]、[35]。从机械生物学的角度来看，实体瘤的组织硬度通常高于健康组织，这是由于细胞外基质密度的增加，这种硬度阻碍了治疗药物在肿瘤细胞内的有效递送，降低了PROTAC的效果[34]、[36]、[37]。本文旨在概述PROTAC进入细胞的最新方法，以理解PROTAC设计的结构和细胞基础。
部分摘录
改善PROTAC跨细胞膜转运的策略
有多种策略可以实现PROTAC分子跨细胞膜的转运。本文概述了目前可用的方法，并讨论了将PROTAC靶向递送到特定细胞的潜在实用方法，以确定未来的研究方向。这些方法包括抗体-PROTAC缀合物；细胞穿透肽（CPPs）和肿瘤穿透肽（TPPs）等渗透序列；前药策略；以及纳米粒子（如有机纳米粒子、无机纳米粒子等）。
结论
尽管PROTAC设计取得了显著进展，但在其高效进入靶组织和细胞以及控制其释放到细胞质方面仍存在挑战。近年来，已经出现了一些方法来促进它们进入细胞和组织。例如，与PROTAC结合的抗体可以结合到特定的细胞表面受体上，通过内吞作用触发其内化。此外，渗透序列也可以帮助PROTAC的转运。
作者贡献声明
Fatemeh Veisi：撰写原始草稿，软件操作。
Farangis Ataei：撰写、审稿和编辑，验证，监督，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了塔比亚特莫达雷斯大学研究委员会的支持。
