伯克霍尔德菌宿主的基因组最小化

《Metabolic Engineering》：Genome minimization of a Burkholderia bacterial host

基因组最小化策略优化Burkholderia sp. FERM BP-3421作为异源宿主，通过转录组数据指导删除p1质粒的spliceostatin基因簇提升capistruin产量，但删除p2质粒单独操作会显著降低聚酮类非核糖体多肽（如glidobactin A和megapolipeptin A）的合成效率，而双质粒删除后产量恢复。

　　

Bruno S. Paulo | Sean B. Romanowski | Adjo E. Kadjo | Vitor B. Lourenzon | Alessandra S. Eustáquio

伊利诺伊大学芝加哥分校Retzky药学院药学科学系与生物分子科学中心，美国伊利诺伊州芝加哥

摘要

基因组最小化，包括删除编码天然产物的内源性基因簇，是一种提高异源产物产量的常见策略。我们一直致力于将Burkholderia sp. FERM BP-3421作为替代细菌宿主进行研究。为了避免无差别地删除基因簇（这可能会产生不利影响），我们根据生产培养物的转录组数据来指导我们的工作。FERM BP-3421的基因组分为两条染色体和两个质粒。转录水平最高的基因簇分别是位于质粒p1上的聚酮类非核糖体肽拼接抑制剂（spliceostatins）基因簇，以及位于染色体1上的非核糖体肽selethramide基因簇。研究表明，删除拼接抑制剂基因簇可以提高核糖体肽capistruin的产量，而删除selethramide基因簇对capistruin的产量没有影响。接下来，我们使用CRISPR-Cas12a技术针对这两个内源性质粒进行改造，使基因组大小减少了11%。经过改造的菌株表现出更好的生长性能，capistruin的产量增加了20-40%，具体取决于删除的是一个还是两个质粒。然而，单独删除质粒p2会对两种不同的聚酮类非核糖体肽的异源表达产生负面影响：p2^-菌株产生的glidobactin A和megapolipeptin A的产量仅为野生型的5-23%，而在p1^- p2^-菌株中，产量恢复到了野生型水平。观察到p2质粒含有支持聚酮类非核糖体肽生物合成的功能，这一发现为未来研究这些功能以及进一步进行工程改造奠定了基础。

引言

基因组最小化不仅有助于理解基本生物学原理，还能改善异源宿主的生长性能和生产力（Kim等人，2024年）。通常被移除的基因包括移动元件、噬菌体和编码天然产物的生物合成基因簇（BGCs）（Kim等人，2024年）。研究表明，基因组缩减可以提高异源产物的产量（Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Vollmann等人，2025年），并可能带来其他意想不到但有益的特性，如提高DNA转移效率和质粒稳定性（Pósfai等人，2006年）。然而，也可能出现不良表型，例如对生长产生负面影响（Liu等人，2021年）。 作为一种替代基因组缩减的方法，有些人选择使用本身基因组已经高度简化的细菌菌株（Zaburannyi等人，2014年）。但反对这一观点的观点认为，具有更多BGCs的细菌可能更适合生产多种天然产物。例如，最近的一项研究表明，具有大量BGCs的细菌拥有共同进化的基因，这些基因有助于天然产物的生物合成（Wang等人，2024年）。作者们（Wang等人，2024年）鉴定出不同类别的共同进化基因，并证明其中一些基因的表达可以增强不同菌株中的天然产物合成。 非模式细菌越来越多地被用作异源基因表达（Chan等人，2025年）或内源基因表达（Poppeliers等人，2025年）的平台。因此，基因组缩减不仅应用于模式细菌如大肠杆菌（Pósfai等人，2006年）和枯草芽孢杆菌（Morimoto等人，2008年），还应用于替代宿主的开发，如链霉菌（Komatsu等人，2010年）和黏细菌（Vollmann等人，2025年）。除了大肠杆菌之外，其他值得注意的假单胞菌属宿主还包括Cupriavidus necator（Calvey等人，2023年；Della Valle等人，2025年）和Pseudomonas putida（Martínez-García等人，2014年；Martínez-García和De Lorenzo，2016年）。 我们一直致力于将Burkholderia sp. FERM BP-3421作为替代异源宿主，以挖掘Burkholderiales和其他β-变形菌的天然产物潜力（Heard和Eustáquio，2025年；Kunakom和Eustáquio，2019年）。从该菌株中分离出的首批天然产物是拼接抑制剂类化合物，如FR901464（图1A），这是一种用于抗体-药物偶联物的临床前开发的剪接调节剂（Kaida等人，2007年；Nakajima等人，1996年；Puthenveetil等人，2016年）。我们选择FERM BP-3421是因为它之前已被用于工业生产，能够以g/L的产量提供这些拼接抑制剂（Eustáquio等人，2016年）。另一种从该菌株中分离出的天然产物是selethramide（图1A），这是一种促进群体运动的脂肽（Romanowski等人，2023年）。 FERM BP-3421的基因组分为两条染色体和两个质粒，其中至少包含29个BGCs，这些BGCs分布在四个复制子上，编码天然产物，几乎是Burkholderia细菌平均15个BGCs的两倍（Liu和Cheng，2014年）。拼接抑制剂基因簇（fr9）位于质粒p1上，而selethramide基因簇（sel）位于染色体1上（图1B）。另外四个BGCs与已知基因簇有相似性，包括编码铁载体ornibactin的orb、抗生素caryoynencin的cay、抗真菌胺基吡咯硝胺的prn和抗癌化合物romidepsin的dep（Istodax?）；其中只有胺基吡咯硝胺和romidepsin通过质谱检测到（Romanowski等人，2023年）。 在之前将FERM BP-3421开发为异源宿主的努力中，我们获得了基因组、表观基因组和代谢组数据（Romanowski等人，2023年），通过甲基化模拟策略提高了DNA转移效率（Romanowski等人，2023年），并表征了载体（Fernandez等人，2024年）和启动子（Adaikpoh等人，2023年）。我们和其他研究人员已利用该宿主实现了核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPPs）（Fernandez等人，2024年；Kunakom和Eustáquio，2020年；Merrild等人，2025年；Nguyen等人，2024年）和聚酮类非核糖体肽（PK-NRPs）（Paulo等人，2024年）的异源表达。在这些研究中，FERM BP-3421的表现优于大肠杆菌及其天然生产菌株，凸显了其作为替代宿主的实用性。 在本研究中，我们通过针对内源性BGCs来实现基因组最小化。为了避免无差别地删除基因簇（这有时会产生不利影响，Liu等人，2021年），我们根据生产培养物的转录组数据来指导工作。我们认为，针对转录水平最高的BGCs进行删除将产生最大影响，同时将减少不良影响。由于删除质粒p1上的fr9 BGC获得了最佳效果，因此我们接下来针对内源性质粒进行改造，因为质粒通常编码非必需基因，这样可以使基因组大小减少11%。然而，令人意外的是，删除质粒p2对PK-NRP的产量产生了负面影响。

化学试剂、酶和通用实验程序

用于PCR的寡核苷酸购自Sigma-Aldrich。T4连接酶由Thermo Fisher提供。用于PCR的限制酶和Q5高保真聚合酶来自New England Biolabs。质粒DNA的提取使用ZR plasmid miniprep试剂盒（Zymo Research）完成，基因组DNA的提取则使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒（Sigma-Aldrich）按照制造商的说明进行。

细菌菌株

Burkholderia sp FERM BP-3421是从国际专利机构获得的

染色体1编码selethramide，质粒1编码拼接抑制剂，这两个基因簇的转录水平最高

在宿主开发过程中，通过删除内源性BGCs可以创建一个“干净”的背景环境。这不仅有助于检测和分离异源产物，还能提高异源产物的产量（Komatsu等人，2010年；Liu等人，2021年；Vollmann等人，2025年）。我们之前开发了一种基于大豆蛋白胨和甘油的复杂培养基（命名为2S4G），该培养基能够实现高细胞密度和每升高的内源性产物产量

讨论

异源表达有助于加速天然产物的发现。基因组最小化是一种常见的策略，用于去除不必要的功能并提高异源产物的产量（Kim等人，2024年；Komatsu等人，2010年；Morimoto等人，2008年；Pósfai等人，2006年；Vollmann等人，2025年）。然而，哪些功能是多余的并不总是明确的，观察到的效果也可能因具体情境而异。 在基因组最小化过程中，通常会被移除的基因包括移动元件...

CRediT作者贡献声明

Alessandra Eustáquio：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、项目监督、方法学设计、资金筹集、数据分析、概念化。 Adjo E. Kadjo：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。 Vitor B. Lourenzon：方法学设计、实验研究、数据分析。 Bruno S. Paulo：撰写——审稿与编辑、初稿撰写。

未引用的参考文献

Hayes, 2003; Riss等人，2013.

数据可用性

DNA序列已存入NCBI的GenBank数据库，访问代码分别为CP196722（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1^-）、CP196719（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p2^-）、CP196911（Burkholderia sp. FERM BP-3421 p1^- p2^-）和PV932216（质粒pBS018）。RNA序列的访问代码为PRJNA1358255。

利益冲突声明

我们没有需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢日本国立技术评估研究所的国际专利机构提供FERM BP-3421菌株；感谢威斯康星大学麦迪逊分校的Brian F. Pfleger提供glidobactin A标准品；感谢法国巴黎国家自然历史博物馆的Séverine Zirah提供capistruin标准品；感谢西蒙弗雷泽大学的Michael Recchia和Roger Linignton提供megapolipeptin A标准品；以及感谢伊利诺伊大学芝加哥分校的Galen Ptacek提供p2 GO术语分析。