《Frontiers in Plant Science》：Identification and functional analysis of growth- regulating factors involved in abiotic stress response in Chrysanthemum L.
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本综述系统性鉴定了菊花GRF（生长调控因子）基因家族，揭示了其在非生物胁迫（如盐、镉、干旱、温度）应答中的关键作用。研究通过进化分析、表达谱及功能验证（如亚细胞定位、转录自激活 assay），发现CiGRF7在冷和CdCl2胁迫下表达量激增超1000倍，为菊花抗逆育种提供了重要靶点（如CiGRF7）和理论依据。
1 引言
菊花（Chrysanthemum L.）作为一种重要的观赏和药用植物，其生长常受到多种非生物胁迫的不利影响。生长调控因子（GRF）是一类植物特有的转录因子，在调控植物发育、生长过程、激素途径以及环境胁迫适应中发挥着关键作用。然而，菊花物种中的GRF基因家族仍缺乏系统性的研究。为了填补这一空白，本研究对四个菊花物种（C. indicum, C. makinoi, C. nankingense, 和 C. lavandulifolium）中的GRF基因进行了系统性分析，旨在阐明其基因结构、表达模式、理化特性以及顺式调控元件（CREs），为理解菊花抗逆分子机制提供理论基础。
2 材料与方法
2.1 GRF基因家族成员的鉴定
利用保守结构域HMM模型（WRC: PF08879; QLQ: PF08880）通过HMMER和BLASTp从四个菊花物种的基因组中系统鉴定GRF基因，并通过SMART工具验证WRC/QLQ结构域的存在。
2.2 基因结构注释、基序分析及染色体定位
使用GFF文件提取基因结构信息，通过TBtools和R包可视化。利用MEME软件鉴定保守基序。
2.3 系统发育树构建与共线性分析
使用ClustalW进行多序列比对，通过MEGA 7.0构建邻接法（NJ）系统发育树。利用MCScanX进行共线性分析，并通过Circos可视化。
2.4 GRF蛋白理化性质与结构预测
通过ProtParam计算蛋白的氨基酸数量、分子量、理论等电点（pI）和GRAVY值。使用SOPMA预测二级结构，SWISS-MODEL同源建模三级结构。
2.5 选择压力分析
计算GRF基因的同义（Ks）和非同义（Ka）置换率及Ka/Ks比值，评估选择压力。
2.6 顺式作用元件（CREs）预测
提取GRF基因启动子区域上游2000 bp序列，提交至PlantCARE数据库预测CREs，并按功能分类。
2.7 RNA提取与实时定量PCR（qRT-PCR）分析
从C. indicum叶片提取总RNA，反转录合成cDNA。使用CiEF1α作为内参基因，通过2-ΔΔCT方法计算相对表达量。
2.8 植物材料与胁迫处理
以C. indicum为材料，分别施加盐胁迫（NaCl）、重金属胁迫（CdCl2）、干旱胁迫、冷胁迫（4°C）和热胁迫（45°C），在不同时间点取样。
2.9 亚细胞定位
将CiGRF7的编码序列（CDS）克隆至pBin-GFP载体，通过农杆菌介导法瞬时转化本氏烟草叶片，利用共聚焦显微镜观察GFP荧光信号。
2.10 转录激活 assay
将CiGRF7的CDS克隆至pGBKT7和pGADT7载体，转化酵母AH109菌株，通过在缺陷培养基上的生长情况评估转录自激活能力。
2.11 统计分析
所有实验设三个生物学重复，使用GraphPad Prism 9进行Student‘s t检验分析显著性。
3 结果
3.1 菊花物种GRF基因家族的鉴定与特征
共鉴定出43个GRF基因，其中C. indicum 9个，C. makinoi 11个，C. nankingense 11个，C. lavandulifolium 12个。染色体分布不均，多富集于4号和5号染色体。系统发育分析将43个GRF蛋白分为4个主要分支（Clade），其中Clade 1成员最多。理化性质分析显示GRF蛋白长度、分子量等存在多样性。
3.2 GRF基因结构与基序分析
基因结构分析显示大多数GRF基因含有3-4个外显子。MEME鉴定出8个保守基序，Motif 1和Motif 2在大多数成员中存在。同一分支成员具有相似的基序组成。二级结构预测显示随机卷曲占主导。
3.3 GRF基因的共线性与复制分析
共线性分析显示C. indicum与C. nankingense之间共线性关系最强。共检测到5个片段复制事件，Ka/Ks比值均小于1，表明GRF基因在进化中经历了纯化选择。
3.4 GRF基因的时空表达分析
表达谱分析显示大多数CiGRFs在花蕾发育阶段显著上调，CiGRF4和CiGRF6在营养器官中表达较高，而CiGRF1, CiGRF3, CiGRF5和CiGRF9在所有组织中表达量均较低，表明其功能具有多样性和复杂性。
3.5 GRF基因启动子顺式作用元件（CREs）分析
启动子分析发现，C. indicum的GRF基因启动子中含有大量胁迫响应元件（占55.18%），其次是生长发育相关元件（32.12%）和激素响应元件（12.69%）。MYB和MYC结合位点广泛分布。不同物种间CREs组成存在差异，C. makinoi的GRF启动子中特有ABA响应元件ABRE。
3.6 非生物胁迫下GRF基因的表达分析
qRT-PCR分析表明，所有9个CiGRFs在至少一种胁迫条件下表达上调。CiGRF6和CiGRF8对NaCl处理响应强烈。CiGRF7对CdCl2胁迫响应迅速，且在冷和CdCl2胁迫下表达量增加超过1000倍。多数基因在胁迫处理24小时内呈现双相表达峰值。
3.7 CiGRF7的亚细胞定位与转录激活
亚细胞定位证实CiGRF7定位于细胞核。酵母转录激活 assay 证明CiGRF7具有自激活能力，并能形成二聚体，表明其作为转录激活因子发挥作用。
4 讨论
本研究在四个菊花物种中鉴定出43个GRF基因，其数量与拟南芥、水稻等模式植物相当。进化分析表明GRF基因的扩张主要受全基因组复制（WGD）和片段复制驱动。基因结构和基序分析显示了高度的保守性。表达谱和启动子分析揭示了GRF基因在菊花生长发育和非生物胁迫响应中的潜在重要作用。特别是CiGRF7，在多种胁迫下显著诱导表达，且被证实为定位于细胞核的转录激活因子，其C端可变区可能包含转录激活域。这些发现为深入解析GRF在菊花抗逆性中的功能奠定了基础，并为菊花抗逆育种提供了宝贵的基因资源。未来的研究需要通过遗传操作等手段进一步验证CiGRF7及其他GRF成员在体内的具体功能及其调控网络。
5 结论
本研究系统鉴定了四个菊花物种中的43个GRF基因，并对其进行了进化、结构和表达分析。研究发现CiGRF7在冷和CdCl2胁迫下表达显著上调，并证实其具有核定位和转录激活能力。这些结果深化了对菊花GRF基因家族功能的理解，为菊花抗逆育种提供了重要的候选基因和理论支持。
