《Frontiers in Immunology》：Paeoniflorin attenuates sepsis-induced liver injury by reprogramming macrophage polarization via the TLR4/NF-κB pathway
引言
脓毒症（Sepsis）作为一种危及生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起，是重症监护病房高死亡率的主要原因。肝脏作为核心免疫器官，在宿主防御病原体中起关键作用，极易受到脓毒症相关损伤。脓毒症相关肝损伤（SALI）是常见且严重的并发症，约20-50%的脓毒症病例中发生，其发展与死亡率独立相关。当前脓毒症治疗策略主要侧重于早期抗菌治疗、源头控制和器官支持性护理，但缺乏针对肝脏失控炎症级联反应的靶向干预措施，凸显了对新型肝脏保护药物的迫切需求。
SALI的病理生理学涉及炎症介质和免疫细胞失调的复杂相互作用。在肝脏微环境中，巨噬细胞具有双重影响，既是损伤的促成者也是调节者。响应病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），巨噬细胞可极化为促炎M1表型，其特征是释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）等细胞因子。这种M1驱动的“细胞因子风暴”导致肝细胞凋亡、微循环功能障碍和最终器官衰竭。相反，替代性M2极化状态促进炎症消退、组织修复和稳态恢复。因此，M1和M2巨噬细胞之间的动态平衡是脓毒症中肝脏结局的关键决定因素，使得巨噬细胞极化的调节成为有前景的治疗策略。
Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信号轴是驱动M1极化和后续炎症损伤的主要通路。TLR4被脂多糖（LPS）等配体激活后，触发下游级联反应，导致NF-κB易位至细胞核，启动促炎基因的转录。药理学抑制该通路已被证明可减轻实验性脓毒症中的过度炎症并改善器官损伤，凸显了其治疗相关性。然而，合成TLR4/NF-κB抑制剂的临床转化因特异性和副作用方面的挑战而受阻，研究兴趣转向具有良好安全性和多靶点潜力的天然来源化合物。
Paeoniflorin是从芍药（Paeonia lactiflora Pall.）根部分离的主要生物活性单萜苷，因其在多种疾病模型中的抗炎、免疫调节和器官保护特性而受到关注。先前研究报道了其在脑缺血、类风湿性关节炎和肝纤维化等疾病中的有益作用，通常将这些作用归因于对炎症信号的抑制。值得注意的是，新出现的证据表明Paeoniflorin可以影响巨噬细胞功能和极化。然而，其在SALI背景下的具体作用和机制，特别是通过TLR4/NF-κB通路调节巨噬细胞极化方面，仍未完全阐明。
基于此背景，本研究旨在评估Paeoniflorin对SALI的治疗潜力并阐明其潜在机制。使用盲肠结扎穿孔（CLP）小鼠模型结合转录组学和分子分析，我们检验了以下假设：Paeoniflorin通过抑制TLR4/NF-κB通路促进巨噬细胞从M1向M2表型极化，从而保护肝脏免受损伤。
材料与方法
小鼠模型建立
105只雄性C57BL/6小鼠（8周龄，20-25克）购自同济大学动物中心（上海），饲养在受控条件（20-22°C，12小时光/暗循环）的独立通风笼中，自由获取标准饲料和水。所有涉及动物的实验程序均经同济大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号TJBB07324108）。研究遵循美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南以及ARRIVE 2.0指南进行。所有努力均用于最小化动物痛苦并使用最少数量动物获取可靠数据。经过一周适应期后，小鼠随机分配至以下组别（每组n=15）：假手术组（Sham）、CLP组、CLP+Paeoniflorin（30、60或120 mg/kg）组、CLP+Paeoniflorin（120 mg/kg）+ TLR4激动剂（RS09 TFA，10 μg/kg）组和Paeoniflorin单独（120 mg/kg）组。Paeoniflorin每日灌胃给药七天，而RS09 TFA在同一时期每日腹腔注射一次。Paeoniflorin溶解在生理盐水（或0.5%羧甲基纤维素钠）中，每日灌胃给药，体积为10 mL/kg体重，连续七天。
样本量确定和功效分析基于实验室先前CLP模型经验和文献中研究脓毒症肝脏保护剂的可比研究。对于关键连续结局指标（如血清ALT/AST），预实验（每组n=3）显示CLP组和治疗组之间的预期效应大小（Cohen's d）约为2.0。使用G*Power软件（3.1版），α水平0.05，期望功效（1-β）0.80，双尾t检验估计每组所需样本量为5-6只动物。为考虑CLP组潜在死亡率、确保多组比较（ANOVA）的稳健统计分析并提供足够组织进行多重下游检测，我们将生存研究的样本量增加至每组n=15，生化和分子分析的样本量增加至每组n=6（从存活者中随机选择）。该样本量符合实验性脓毒症研究中广泛接受的标准。
第7天，通过CLP诱导多微生物脓毒症。简要而言，小鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉，在无菌条件下行中线剖腹术。暴露盲肠，在回盲瓣远端结扎而不引起肠梗阻，然后用21号针头贯穿穿刺。挤出少量粪便内容物以确保通畅。将盲肠放回腹腔，分层缝合切口。假手术组小鼠接受相同外科手术程序，但不进行盲肠结扎和穿刺。手术后24小时，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死小鼠。收集组织和血清样本用于进一步分析。
肝脏组织病理学
肝组织在10%中性缓冲福尔马林中浸泡固定24小时，然后石蜡包埋。制备4 μm厚切片，用苏木精和伊红（H&E）染色进行形态学评估。在光学显微镜（Olympus CX30，日本）下进行病理评估，重点观察小叶结构改变、炎性细胞浸润程度和其他结构异常。
实时定量PCR（qPCR）
肝标本在液氮中速冻，-80°C保存直至使用。使用Trizol试剂（15596026，Invitrogen，美国）按照制造商说明提取总RNA。从等量RNA合成cDNA，随后使用通用SYBR FAST qPCR试剂盒主混合物（KAPA Biosystems，美国）在实时PCR系统上扩增。热循环程序包括95°C初始变性10分钟，随后45个循环的95°C 10秒、59°C 60秒和72°C 15秒，最后95°C延伸15秒。使用以下引物序列（Invitrogen，上海）进行扩增：
TNF-α：F: 5′-GTTCTATGGCCCAGACCCTCAC-3′, R: 5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′
IL-1β：F: 5′-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3′, R: 5′-GAACGTCACCCAGCAGGTTA-3′
IL-6：F: 5′-CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3′, R: 5′-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC-3′
GAPDH（内参）：F: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, R: 5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′
基因表达水平归一化至GAPDH，并使用2–ΔΔCt方法分析。
蛋白质印迹（Western Blotting）
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从匀浆肝组织中提取蛋白质。使用BCA测定试剂盒（Beyotime，中国）测定蛋白质浓度。等量蛋白质（每泳道30 μg）通过10% SDS-PAGE（Bio-Rad Mini-PROTEAN系统）分离，随后转移至PVDF膜。用5%脱脂牛奶TBST在37°C封闭1小时后，膜在4°C与以下一抗孵育过夜：抗TLR4（Abcam, ab13556, 1:1000）、抗NF-κB（Immunoway, #YT5382, 1:1000）、抗磷酸化NF-κB（CST, #67824, 1:1000）和抗GAPDH（Proteintech, #60004-1-Ig, 1:5000）。TBST洗涤三次后，膜与相应的HRP偶联二抗（Beyotime或Proteintech, 1:2000）在室温孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）检测系统可视化蛋白质条带，并使用ImageJ软件（v1.50i）通过光密度法定量条带强度。GAPDH作为内参加载对照进行归一化。
免疫组织化学
石蜡包埋切片脱蜡、水化。使用压力锅在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行热诱导表位修复。用3%过氧化氢孵育15分钟淬灭内源性过氧化物酶活性，用5%牛血清白蛋白在室温封闭20分钟阻断非特异性结合位点。切片随后在4°C与以下一抗孵育过夜：抗CD206（CST, #E6T5J, 1:500）、抗CD86（CST, #E5W6H, 1:500）和抗F4/80（Wanlei, #WLH2545, 1:500）。洗涤后，切片与HRP偶联二抗（Beyotime, 1:700）在室温孵育1小时。使用3,3’-二氨基联苯胺（DAB）底物可视化免疫反应性，随后用苏木精复染。最后，所有切片使用高分辨率切片扫描仪进行数字扫描用于后续分析。定量分析中，每张切片随机选择五个非重叠高倍视野（HPF, 400倍放大）。所有定量由两名对实验分组不知情的独立研究者进行。手动计数阳性细胞或使用ImageJ软件（v1.50i）测量积分光密度，应用一致的阈值设置。使用两名研究者的平均值进行统计分析。
TUNEL染色
使用TUNEL凋亡检测试剂盒（Beyotime, #C1088）按照制造商方案检测肝组织中的凋亡细胞。简要而言，脱蜡和水化后，组织切片用1%多聚甲醛在室温固定15分钟，然后用蛋白酶K（20 μg/mL）在37°C处理10分钟。随后切片在37°C黑暗湿盒中与TUNEL反应混合物孵育60分钟。细胞核用DAPI复染，载玻片用抗淬灭封片剂（Solarbio）封片。每张切片随机选择五个视野，在荧光显微镜（Olympus IX71）下100倍放大成像。使用ImageJ软件定量TUNEL阳性细胞数，并表示为总DAPI染色细胞核的百分比。
肝功能检测
使用商业测定试剂盒（ALT, C009-2-1; AST, C010-2-1; 南京建成生物工程研究所，中国）按照制造商说明定量血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。在Olympus AU400自动生化分析仪上进行测量。酶活性表示为单位每升（U/L）。
RNA测序（RNA-seq）
从脓毒症和Paeoniflorin处理的脓毒症小鼠肝组织提取总RNA（每组n=4）。使用Agilent 2100 Bioanalyzer验证RNA完整性，并按照制造商说明构建测序文库。文库在Illumina NovaSeq 6000平台（Novogene，北京）上测序，生成150 bp双末端读长。质量控制和接头修剪后，使用HISAT2（v2.0.5）将清洁读长比对到小鼠参考基因组（GRCm39）。使用featureCounts（v1.5.0-p3）进行基因水平计数，表达水平归一化为每千碱基转录本每百万映射读长的片段数（FPKM）。使用DESeq2进行差异表达分析，显著性定义为绝对log2倍数变化 > 1.5且Benjamini-Hochberg调整后p值（FDR） < 0.05。满足这些标准的基因被定义为差异表达基因（DEGs），并进行KEGG通路富集分析以识别显著改变的生物通路。
统计分析
所有数据表示为平均值±标准误（SEM）。使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey真实显著差异（HSD）事后检验进行多重比较。Tukey检验控制ANOVA模型内所有成对比较的族系误差率。正态分布的两组间差异使用Student t检验分析。不符合正态假设的数据，相应采用Kruskal–Wallis检验（多组）或Mann–Whitney U检验（两组）。双尾P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
Paeoniflorin通过促进巨噬细胞M2极化减轻脓毒症诱导的肝损伤
为研究Paeoniflorin在SALI中的肝脏保护机制，我们首先评估了关键肝损伤标志物和免疫反应。使用Kaplan-Meier法进行的生存分析显示，与假手术组相比，CLP组在24小时内的生存概率显著较低。然而，Paeoniflorin（120 mg/kg）给药显著提高了脓毒症小鼠的存活率（与CLP组相比p < 0.05，对数秩检验）。接受CLP手术的小鼠血清ALT和AST水平显著升高，Paeoniflorin治疗以剂量依赖方式降低了这些水平。与这些发现一致，qPCR分析显示CLP手术显著上调了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA表达，而Paeoniflorin给药显著抑制了这些增加。H&E染色肝切片的组织病理学评估显示，CLP小鼠出现严重的小叶结构紊乱、水肿、炎性细胞浸润和出血。这些结构异常在Paeoniflorin治疗组中显著减轻。免疫荧光分析进一步显示CLP诱导的脓毒症肝脏中F4/80+CD86+M1巨噬细胞广泛浸润。相反，Paeoniflorin促进了F4/80+CD206+M2巨噬细胞的显著增加，表明巨噬细胞极化从促炎M1向抗炎M2表型转变。此外，TUNEL染色显示脓毒症小鼠肝细胞凋亡显著，Paeoniflorin干预后明显减弱。总之，这些结果表明Paeoniflorin通过促进M2巨噬细胞极化重编程肝脏免疫微环境，从而有效改善脓毒症诱导的肝损伤。
Paeoniflorin通过调节NF-κB信号通路改善脓毒症诱导的肝损伤
为进一步阐明Paeoniflorin保护作用的分子机制，我们对经Paeoniflorin处理或未处理的CLP诱导脓毒症小鼠肝组织进行了转录组分析（每组n=4）。全局转录组的主成分分析（PCA）和均匀流形近似与投影（UMAP）显示CLP组和CLP+Paeoniflorin组之间明显分离，表明不同的转录组谱。治疗组间前50个DEGs的热图。差异基因表达分析识别出许多显著改变的基因，火山图可视化显示脓毒症响应中广泛的转录重编程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析进一步将NF-κB信号通路识别为CLP组中最显著上调的通路，并且还发现与Paeoniflorin治疗组相比，TLR4在CLP组中表达更高。总之，这些转录组学发现表明Paeoniflorin通过抑制TLR4/NF-κB信号激活，从而抑制促炎M1巨噬细胞极化，减轻脓毒症相关肝损伤。1.5，调整后p < 0.05）。(E) DEGs的KEGG通路富集分析，显示NF-κB信号通路为最显著富集的通路。">
TLR4抑制对Paeoniflorin的肝脏保护作用至关重要
为确定TLR4信号是否介导Paeoniflorin的肝脏保护作用，我们在TLR4药理学激活条件下评估了关键肝损伤参数。与我们之前的观察一致，Paeoniflorin治疗显著减弱了CLP诱导的血清AST和ALT水平升高；然而，TLR4激动剂RS09 TFA的联合给药完全逆转了这种保护作用，导致转氨酶再次升高。相应地，qPCR分析表明Paeoniflorin显著抑制了CLP诱导的促炎细胞因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）mRNA表达，而RS09 TFA联合治疗恢复了它们的过表达。通过H&E染色的组织病理学检查显示，RS09 TFA给药加剧了小叶结构破坏、水肿和炎性细胞浸润，与Paeoniflorin治疗组中保存完好的肝脏结构形成对比。免疫荧光分析进一步表明Paeoniflorin促进了巨噬细胞极化的转变，其特征是减少F4/80+CD86+M1巨噬细胞积累和增强F4/80+CD206+M2巨噬细胞浸润。这种效应被RS09 TFA联合治疗所消除。此外，TUNEL测定证实Paeoniflorin显著减少了CLP诱导的肝细胞凋亡，这种抗凋亡效应在TLR4激活后被抵消。总之，这些发现表明TLR4抑制对于Paeoniflorin对抗脓毒症相关肝损伤的保护作用是不可或缺的。
Paeoniflorin通过抑制TLR4/NF-κB信号轴发挥其保护作用
鉴于TLR4激活最终导致NF-κB通路诱导，我们接下来研究Paeoniflorin是否调节该下游信号级联。脓毒症诱导导致总NF-κB p65及其磷酸化形式（p-p65）的肝脏蛋白质水平显著增加。Paeoniflorin治疗有效抑制了总NF-κB和磷酸化NF-κB的表达，而TLR4激动剂RS09 TFA的同时给药恢复了它们的高表达。免疫组织化学分析证实了这些发现，显示脓毒症肝组织中p65和p-p65的强核染色，这在Paeoniflorin治疗后显著减少，但在RS09 TFA联合给药后重新建立。这些在蛋白质印迹和免疫组织化学方法中一致的结果证实，Paeoniflorin通过特异性抑制TLR4介导的NF-κB激活，从而阻止促炎M1巨噬细胞极化并减弱过度炎症反应，减轻脓毒症诱导的肝损伤。我们的研究结果将TLR4/NF-κB通路确立为Paeoniflorin在脓毒症背景下发挥其肝脏保护作用的关键机制靶点。
讨论
脓毒症相关肝损伤仍然是危重患者死亡率的重要贡献者，当前治疗策略对进行性肝功能障碍的保护有限。本研究将Paeoniflorin确立为实验性脓毒症中的有效肝脏保护剂，通过针对炎症信号和细胞重编程的复杂免疫调节机制发挥作用。这些结果不仅证实了Paeoniflorin的治疗潜力，而且为脓毒症发病机制中的巨噬细胞生物学提供了新见解。
Paeoniflorin治疗观察到的强大肝脏保护——通过改善的生化参数、保存的组织结构和减少的细胞凋亡体现——代表了寻找有效SALI疗法的重要进展。特别值得注意的是该化合物同时减轻肝损伤多个方面的能力，表明了一种全面的保护机制。这种多方面的保护与脓毒症管理中最近的范式转变相一致，强调通过综合方法而非孤立干预来解决器官功能障碍的重要性。
我们的发现将Paeoniflorin置于其他已知在脓毒症中调节TLR4/NF-κB通路的天然化合物之中，如姜黄素、白藜芦醇和黄芩苷。虽然这些化合物共享抗炎活性的共同主题，但Paeoniflorin可能提供独特优势。作为单萜苷，其特定的药代动力学特征可能不同。更重要的是，除了抑制促炎信号外，我们的数据突出了Paeoniflorin积极驱动肝脏巨噬细胞从M1向M2表型重极化的强大能力。这种双重作用——同时抑制关键炎症驱动因子（TLR4/NF-κB）和促进促消退免疫微环境——可能为SALI提供更全面的治疗策略，针对损伤传播和组织修复通路。
这些发现在最近单细胞RNA测序研究的背景下获得额外意义，这些研究揭示
