《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Development of a 3D tumor model based on decellularized matrix using high-throughput approaches
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本综述系统阐述了利用脱细胞肿瘤基质构建3D肿瘤模型的最新进展。文章重点探讨了脱细胞化过程对肿瘤微环境（TME）中关键大分子（如胶原蛋白、纤连蛋白、透明质酸HA）和蛋白质（如整合素、MMPs、生长因子）的潜在损伤，并提出了通过战略性重新引入这些组分以增强模型生物相关性的策略。同时，综述还评估了3D生物打印、微流体系统和生物反应器等高通量技术在优化再细胞化、模拟复杂TME中的应用与挑战，为癌症研究、药物发现和个性化治疗提供了有前景的平台。
引言
精准医学旨在开发3D肿瘤模型，以验证新疗法和研究疾病机制，其核心在于分离细胞外基质（ECM）作为体外重建肿瘤的基础。利用脱细胞肿瘤基质为体外癌症研究和治疗测试提供了一个有前景且多功能的平台。肿瘤微环境（TME）是癌组织的周围环境，包含一个复杂的ECM组分和信号蛋白网络，这些成分调控着肿瘤的发生、侵袭和转移。然而，脱细胞化技术过程可能具有破坏性，常常损伤必需的大分子和蛋白质，可能在再细胞化过程中损害生物相关微环境的恢复。
脱细胞化及其挑战
脱细胞化是一个从生物组织中移除活细胞和细胞成分，产生完整ECM的复杂过程。ECM由蛋白质、糖蛋白和生物活性分子组成，维持其相应天然组织的结构和功能特性，并作为细胞再细胞化的最佳3D支架。脱细胞化通常结合物理、化学和酶学方法。物理技术如冻融循环或振荡可以解离细胞，同时保留ECM结构。化学方法使用去垢剂和酸或碱溶液来溶解细胞成分。酶学处理如使用核酸酶进一步降解残留的核酸和细胞碎片。方法的选择取决于所使用的组织类型、所生成ECM的最终目的以及ECM对该方法的敏感性。
脱细胞化的主要挑战在于确保完全移除细胞材料的同时，维持接近天然ECM的功能结构。一个主要障碍是在保持ECM完整性的同时实现充分的细胞移除。所有细胞碎片，包括DNA、RNA和膜相关蛋白，都需要被完全清除以避免宿主免疫排斥。然而，脱细胞化方案，无论是化学、酶学还是物理方法，常常导致ECM完整性的丧失。例如，十二烷基硫酸钠（SDS）等去垢剂能有效溶解细胞膜，但已被证明会破坏重要的ECM蛋白，导致支架机械性能和生物活性的改变。同样，酶学处理（如核酸酶）能降解残留核酸，但也可能损伤负责细胞粘附和信号传导的必需ECM糖蛋白。另一个主要挑战源于待脱细胞组织的异质性。不同组织和器官的细胞密度、ECM组分和结构复杂程度各不相同。这种可变性需要针对特定组织的方案，对标准化和可扩展性构成了挑战。此外，脱细胞化过程中残留的细胞毒性剂（如去垢剂、有机溶剂）若未完全清除，会阻碍再细胞化，对接种细胞产生毒性环境。脱细胞化过程还会引起ECM的机械和功能变化，如刚度、弹性或孔隙度的改变，这可能破坏细胞增殖和分化所需的天然信号。在转化层面，将脱细胞化方法规模化应用于大型、复杂的组织和器官系统也面临巨大挑战。
再细胞化及其局限性
脱细胞肿瘤组织的再细胞化是开发三维癌症模型的关键过程。这一过程遇到显著困难，阻碍其有效性，包括细胞分布不均、细胞活力差和血管化不足。再细胞化的一个基本问题是在整个脱细胞基质中实现均匀的细胞分布。研究表明，可变的孔隙度和改变的ECM组成可能阻碍细胞浸润和粘附，导致异常的组织再生和无法准确复制天然组织结构。尽管接种技术有所进步，但研究人员观察到细胞迁移的可变性，尤其是在支架较致密的区域。维持植入生物支架中细胞的活力和功能是组织工程领域的另一个主要挑战。关键生物活性分子（包括细胞因子和生长因子）的移除可能导致结构完整性和植入环境中细胞存活率的下降。最近的研究结果表明，缺乏这些关键组分显著破坏了支架内的细胞代谢和通讯。再细胞化最重要的限制之一是支架内缺乏功能性血管网络。科学家报告称，血管化不足会导致基质深层细胞缺氧和营养缺乏，从而导致增殖减少和死亡增加。替代方法包括与内皮细胞共培养和预血管化技术以改善再细胞化；然而，结果表明这些方法不足以建立持久的功能性血管。
肿瘤微环境中的大分子
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蛋白聚糖（多能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖）：如多能蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖是ECM的主要组分，参与调节细胞-基质相互作用、ECM结构和肿瘤进展。这些高分子量大分子由一个核心蛋白组成，糖胺聚糖（GAGs）共价连接其上。多能蛋白聚糖是肿瘤间质中丰富的蛋白聚糖，它与透明质酸（HA）和ECM的其他组分结合以改善细胞迁移。此外，多能蛋白聚糖通过整合素激活FAK/MAPK信号，可增加细胞增殖和迁移。在癌症中，多能蛋白聚糖表达水平相对较高，并与肿瘤侵袭性相关。通过结合生长因子和细胞因子，多能蛋白聚糖改变局部微环境以促进肿瘤细胞增殖、迁移和免疫逃逸。另一个结构重要的蛋白聚糖是双糖链蛋白聚糖，它有助于ECM组织并在细胞粘附中发挥作用。双糖链蛋白聚糖能够结合TGF-β，后者在ECM重塑和纤维化中起重要作用，导致肿瘤刚度增加和侵袭。
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胶原蛋白：胶原蛋白（人体中已鉴定28种）是ECM中最丰富的蛋白质，作为关键的结构成分，为组织提供机械稳定性和支持。在TME内，胶原纤维形成一个复杂的支架，不仅支撑肿瘤细胞和基质成分，还积极参与肿瘤进展。在各种ECM胶原类型中，I型和III型胶原主要由癌症相关成纤维细胞（CAFs）表达，它们是塑造肿瘤间质的关键参与者。这些胶原蛋白有助于间质硬化，这是调节癌症细胞行为（如侵袭、转移和治疗抵抗）的重要因素。肿瘤细胞表面的整合素与胶原蛋白结合，激活促进细胞存活、迁移和增殖的通路。胶原蛋白-整合素结合后激活的主要通路是粘着斑激酶（FAK）/Src信号通路。FAK自磷酸化激活Src家族激酶，后者磷酸化接头蛋白如桩蛋白和塔林。这些事件导致细胞骨架重排，从而实现细胞的迁移和侵袭。此外，FAK/Src通路激活下游介质，如Rho GTP酶（RhoA、Rac1和Cdc42），它们控制肌动蛋白聚合和片状伪足形成，这对运动性至关重要。胶原蛋白-整合素结合同时激活PI3K/AKT通路。整合素簇募集并激活PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶），产生PIP3，随后激活AKT。AKT通路磷酸化参与细胞存活（如GSK3β）、生长（如mTOR）和迁移（如BAD）的关键底物，抑制凋亡并促进代谢活性。胶原蛋白和整合素之间的相互作用激活MAPK/ERK通路（丝裂原活化蛋白激酶）。FAK和Src的激活激活Ras-Raf-MEK-ERK通路，导致ERK1/2磷酸化。激活后，ERK易位至细胞核，调节转录因子如AP-1，导致表达促进增殖、迁移和血管生成的基因。此外，胶原蛋白已被证明能促进YAP/TAZ激活，部分通过机械接合和基质刚度。整合素将细胞外物理信号传递至细胞骨架，诱导YAP/TAZ核转位，在那里它们作为转录共激活因子增加促进肿瘤进展的基因表达。而且，胶原蛋白-整合素相互作用调节NF-κB活性，促进炎症、细胞存活和转移。
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纤连蛋白：纤连蛋白是另一种重要的ECM糖蛋白，在细胞粘附、迁移和ECM重塑中起关键作用。在肿瘤间质发育过程中，纤连蛋白在间质中高表达，维持ECM的结构完整性。纤连蛋白作为整合素和其他ECM组分之间的桥梁，促进肿瘤细胞粘附和运动。在肿瘤环境中，纤连蛋白在转移过程中促进癌细胞迁移，并增加肿瘤间质刚度，这是一个在癌症进展中具有显著相关性的可调特性。肿瘤细胞上的α5β1和αvβ3整合素与纤连蛋白之间的相互作用启动FAK/Src信号通路，诱导细胞骨架重塑和粘着斑形成，从而促进癌细胞转移。值得注意的是，纤连蛋白与胶原蛋白的聚合通过赖氨酰氧化酶（LOX）介导的交联机制有助于ECM硬化。这种增加的刚度通过YAP/TAZ信号激活机械转导通路，可进一步驱动癌症发展。
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透明质酸：透明质酸（HA）是一种多糖，是各种组织（包括肿瘤）ECM中的另一个组分。HA在TME中扮演多重角色，如细胞迁移、ECM重塑和组织修复。肿瘤中HA水平升高通常与癌症进展相关，因为HA丰富的基质增加ECM沉积，创造一个有利于癌细胞侵袭的微环境。此外，HA调节ECM的机械特性，如组织刚度，直接影响肿瘤细胞行为。在脱细胞化过程中，HA常常被清除，导致这些重要功能的丧失，如调节肿瘤细胞粘附和迁移。HA的耗竭还可能导致ECM的柔韧性和对再细胞化的容许性降低。将HA添加到脱细胞组织中还可以增强基质机械性能，有助于细胞滞留和迁移，从而改善再细胞化。此外，HA与癌细胞表面受体（如CD44和RHAMM）结合，激活下游信号通路，包括PI3K/AKT和MAPK通路，这些通路调节增殖、存活、迁移和侵袭过程。
对肿瘤细胞行为和再细胞化至关重要的蛋白质
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层粘连蛋白和新发现的变体：层粘连蛋白是基底膜的关键结构成分，以其在TME中的作用而闻名，特别是在调节细胞活性方面。层粘连蛋白亚型在癌症进展过程中的新功能作用最近得到认识。例如，层粘连蛋白-411（α4β1γ1）在侵袭性癌症中上调，并与肿瘤细胞迁移和转移增加相关。由这种变体介导的整合素信号允许癌细胞适应疾病的更晚期阶段，同时有利于肿瘤细胞的存活和迁移。此外，最近的报告表明，层粘连蛋白-511（α5β1γ1）与CD44的相互作用参与了几种癌细胞的上皮-间质转化（EMT）。
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纤连蛋白相关蛋白，腱糖蛋白-C：腱糖蛋白-C（TNC）是一种在肿瘤中上调的糖蛋白，特别是在间质区室中，它通过增加与整合素和其他ECM组分的相互作用间接促进肿瘤发生和转移。最近的研究表明，它可以调节ECM的刚度和弹性，同时在2D和3D模型中调节癌细胞行为。它增强癌细胞迁移并有助于肿瘤相关炎症，使其成为重建有效TME的关键因素。从机制上讲，TNC通过整合素和Toll样受体（TLR）介导的信号通路促进肿瘤进展。TNC与癌细胞和基质细胞上的整合素（α9β1和αvβ3）相互作用，激活FAK、PI3K/AKT和MAPK通路，促进细胞增殖和迁移。值得注意的是，TNC与TLR4相互作用，导致NF-κB激活，从而增加炎症反应和免疫逃逸。TNC还通过生长因子调节（如VEGF）调节EMT和血管生成。
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骨膜蛋白：骨膜蛋白是一种已知与整合素和其他ECM组分相互作用的ECM蛋白，也被新认为是肿瘤进展和转移扩散的促进剂。它在ECM重塑中的参与及其在肿瘤血管生成、侵袭和化疗抵抗中的关键作用已被广泛记录。骨膜蛋白还与不同的肿瘤相关细胞（如CAFs和免疫细胞）相互作用，以协助肿瘤环境的重塑。骨膜蛋白通过自分泌机制诱导癌细胞中的整合素/ERK/NF-κB轴，导致不同细胞因子的分泌，包括MIP-1β（巨噬细胞炎症蛋白-1β）、MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）、TNFα（肿瘤坏死因子-α）和RANTES。这些细胞因子促进THP-1单核细胞的募集和趋化性，然后这些细胞可以在体外极化为M2巨噬细胞。已经证明骨膜蛋白与CAFs上的整合素（如αvβ3、αvβ5和α6β4）结合，激活FAK/PI3K/AKT和MAPK信号通路，这些通路介导CAF激活、增殖和ECM组分（如胶原蛋白和纤连蛋白）的分泌。这些因素促进肿瘤间质的强化和组织更僵硬，这也促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外，骨膜蛋白调节TME中的免疫细胞。它还抑制T细胞浸润和功能，有助于免疫抑制环境。
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整合素及其配体：整合素是跨膜受体，促进细胞对ECM组分的一般和特异性粘附功能。这些受体在控制细胞迁移、存活和分化中起关键作用。这些受体促进细胞对ECM组分的普遍和特异性粘附功能。整合素是α和β亚基的异二聚体，每个亚基对不同的配体具有结合特异性，如αvβ3和α5β1对纤连蛋白，α6β4对层粘连蛋白，α2β1对胶原蛋白。癌症中的整合素失调通过与其他生长因子受体的串扰驱动肿瘤细胞侵袭和转移。整合素信号传导主要由FAK和Src通路介导，激活下游效应器如PI3K/AKT、Rho GTPases和MAPKs。这些级联促进细胞骨架重塑、增殖和EMT。此外，整合素通过VEGF激活和TME刚度的调节诱导血管生成信号。
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基质金属蛋白酶（MMPs）：MMPs构成一组负责ECM组分降解和重塑的酶。这些过程不仅对ECM稳态至关重要，而且对癌细胞迁移和血管生成也至关重要。MMPs，如MMP-2、MMP-9和MMP-14，在肿瘤中上调，并通过降解ECM促进肿瘤侵袭性，促进癌细胞的迁移和侵袭到周围组织。研究表明，MMPs促进脱细胞ECM的重塑，使其更接近天然TME。通过将MMPs重新引入脱细胞支架，可以通过允许癌细胞在组织中重新定居时重塑ECM来进一步改善再细胞化过程。
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生长因子（如VEGF、FGF、TGF-β）：生长因子是调节细胞增殖、分化和存活的信号分子。TME内的肿瘤生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和转化生长因子-β（TGF-β），是驱动肿瘤生长和转移的一些因素。VEGF激活血管生成以发展血管网络，确保营养供应给生长的肿瘤。FGF刺激肿瘤细胞增殖和血管生成。TGF-β参与EMT，增强细胞运动性和侵袭性。在再细胞化过程中，这些生长因子可能不再对肿瘤细胞可用，因为它们可能在脱细胞化过程中被消除和/或降解而无法恢复。为了在再细胞化支架中诱导TME，必须重新引入生长因子以促进肿瘤细胞增殖、迁移和血管生成。这使得脱细胞基质能更好地模拟天然肿瘤环境，从而提高癌症模型的准确性，并促进其在药物筛选和其他实验中的应用。
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富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）：SPARC，或骨连接素，是一种与ECM组分结合的基质细胞蛋白。除了调节ECM重塑外，SPARC还调节细胞粘附、迁移和分化。在TME内，SPARC参与ECM的调节，促进肿瘤细胞生长和侵袭。另一方面，据报道SPARC与整合素和MMPs相互作用，重塑ECM并增加细胞运动性。SPARC在肿瘤中经常过度表达，并与不良预后和增加的侵袭性相关。因此，通过将SPARC加载到脱细胞肿瘤组织中，可以增强再细胞化过程，使细胞以更有效的方式重塑ECM。
改善再细胞化的策略
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ECM-细胞相互作用对有效再细胞化的重要性：脱细胞肿瘤组织的成功再细胞化需要保留或恢复关键的ECM-细胞相互作用，这些相互作用调节多种细胞功能，包括粘附、迁移、分化和存活。将分子嵌入脱细胞支架显著改善了细胞的粘附和迁移，从而改善了它们的再细胞化。这一阶段包括将肿瘤细胞、成纤维细胞和其他相关细胞类型接种到脱细胞支架中。这些蛋白质与ECM相互作用，它们在支架中的增殖和组织取决于ECM蛋白质的完整性及其与细胞表面受体（如整合素和CD44）的相互作用。通过重新引入关键的ECM组分，如层粘连蛋白-111、纤连蛋白和HA，为肿瘤细胞重建其匹配/天然微环境提供了更具支持性的环境。实现这种恢复的一种方法是通过在用于3D生物打印的支架或生物墨水中涂层或嵌入这些蛋白质。最近的研究建议使用与肿瘤ECM机械特性密切相似的生物材料，包括水凝胶和脱细胞组织衍生材料，以增强再细胞化。这些材料允许细胞生长，保留支架的类肿瘤特性，并使肿瘤细胞的行为与它们在天然TME中的行为相似。此外，信号分子、生长因子或细胞因子的应用可以驱动细胞行为以提高再细胞化效率。因此，ECM结构蛋白与其他必需因子的组合代表了重现肿瘤条件和促进成功再细胞化的有吸引力的策略。
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3D生物打印：目前，3D生物打印为制造反映TME的复杂组织模型提供了一个多功能平台。这种高通量技术有助于在支架内精确放置各种细胞类型和ECM蛋白，以开发功能相关和有组织的组织。生物打印技术的最新进展使得能够构建在结构和功能上更接近天然肿瘤的肿瘤模型。因此，3D生物打印技术通过整合脱细胞ECM支架和肿瘤来源的细胞，能够高保真地形成肿瘤组织。通过将大分子和特定蛋白质（如层粘连蛋白、胶原蛋白和纤连蛋白）添加到生物墨水配方中，可以增强肿瘤的模型保真度。此外，打印多种细胞类型，如癌细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞和免疫细胞，可以创建更全面的TME。关于生物墨水，基于脱细胞肿瘤组织或ECM蛋白（如纤维蛋白原和HA）的水凝胶可以显著提高细胞活力和再细胞化。这些水凝胶不仅支持肿瘤细胞的结构完整性，还鼓励肿瘤细胞的时空迁移和增殖。这些技术包括多层和激光辅助打印，能够生产复杂和异质性的3D肿瘤模型。ECM沉积与细胞生物打印的协同组织提供了强大优势，可以构建更具生理相关性的TME，重现体内肿瘤行为和药物反应，以便个性化治疗。
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生长因子和细胞因子用于增强再细胞化：添加这些生长因子（VEGF、TGF-β）将有助于引导肿瘤细胞和成纤维细胞在支架内的迁移、增殖和组织。此外，免疫调节细胞因子如白细胞介素（如IL-6和IL-8）可以调节TME中的免疫反应。这些细胞因子驱动免疫细胞类型的募集和激活或抑制（在TME中具有双重功能），可能恢复再细胞化肿瘤组织中的免疫微环境。从免疫反应的角度来看，将这些细胞因子和生长因子包含在脱细胞支架中最终促进了再细胞化组织的功能化及其模拟天然TME的能力。再细胞化组织内生长因子和细胞因子递送的控制释放系统也在最近的研究中得到探索。例如，这些材料可以掺入纳米颗粒或微颗粒中，随时间释放，以确保材料在影响支架内浓度方面保持有效。这种方法不仅改善了细胞行为，还促进了更活跃的TME。
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微流体系统：微流体系统是一种可用于再细胞化的尖端策略，允许以高时空分辨率操纵细胞接种、营养递送和组织微环境。这种芯片上的微实验室通过微尺度通道设计，通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）等生物相容性材料制成，能够精确控制流体流动。将目标细胞，如成纤维细胞、上皮细胞或悬浮在培养基中的免疫细胞，加载到微流体装置中。在脱细胞支架内，通过控制流速和压力梯度实现均匀的细胞接种。重要的是，由于微流体特有的层流行为，湍流低，允许细胞不仅简单地附着，而且能渗透到支架的深孔中。一旦细胞被接种，微流体装置允许动态灌注培养基、氧气和生长因子，以保持细胞存活并鼓励其增殖。这些系统能够复制生理条件，如机械剪切应力和生化梯度，从而改善细胞功能、分化和支架整合。此外，微流体平台可用于共培养多种细胞类型，以重现复杂的组织微环境，尤其是在癌症领域。集成的传感器和成像工具提供再细胞化效率、细胞分布和活力的实时监测，保证对再细胞化效率的准确评估。
微流体系统具有显著优势。这些技术允许精细控制动态再细胞化过程，相对于静态接种方法，增强了细胞分布和支架定植。该系统重现了体内类似的机械和生化刺激，后者促进了组织样特性和细胞分化。此外，它们的动态灌注特性刺激细胞增殖和整合，高通量设计促进了多个支架的同时处理，以实现可重复性和可扩展性。然而，微流体系统也有其自身的局限性。它们的设计和操作技术性很强，这构成了广泛采用的障碍。与微加工工具和组件相关的成本使这个问题进一步复杂化，特别是在资源有限的环境中。另一个常见的担忧是可扩展性，因为将微流体协议转移到大型组织构造在技术上是高要求的。其次，在动态接种过程中，高剪切应力如果控制不当，也可能降低细胞功能。PDMS的吸收特性也可能由于材料限制而损害某些生物分子的递送。总体而言，该技术在整合生物标志物方面的灵活性使微流体系统成为再细胞化方法的理想候选者。它们通过实现空间控制、动态灌注和微细胞共培养能力，推动组织工程、TME建模和再生医学的进步。克服现有障碍将释放它们在临床和研究应用中的潜力。
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生物反应器：生物反应器是另一种为脱细胞支架的再细胞化维持动态和受控环境的先进设备。与静态培养方法不同，生物反应器整合了机械、生化和流体动力学刺激，促进细胞的均匀分布，提高细胞活力，并促进组织成熟。这些系统对于组织工程至关重要，因为它们模拟生理条件并解决静态培养中经常遇到的扩散限制。生物反应器的基本功能包括耦合流体流动，以灌注含细胞的培养基通过或围绕脱细胞支架。精确调节的流体流动保证了充足的氧气和营养供应，以及有利于细胞生长的代谢废物产品的有效清除。如今，各种类型的生物反应器在实验室中运行，其中一些包括灌注生物反应
