《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Intermittent fasting reduces glaucomatous damage in an HSP27 autoimmune mouse model
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本研究发现，在正常眼压性青光眼小鼠模型中，间歇性禁食（每周3次、每次24小时）虽未引起体重变化，但能有效保护视网膜神经节细胞（RGCs）免受热休克蛋白27（HSP27）诱导的损伤。机制研究表明，禁食通过下调视网膜和血清中肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子，减轻神经炎症反应，同时调节小胶质细胞活性，从而发挥神经保护作用。该研究为青光眼的非药物干预提供了新策略。
背景
青光眼作为全球第二大致盲性眼病，其治疗目前仍局限于降低眼压，而对疾病发展中的其他病理机制了解有限。近年证据表明，免疫介导的组分在青光眼发病中起重要作用，例如在患者血清中检测到抗热休克蛋白27（HSP27）抗体水平升高。前期研究已证实，小鼠玻璃体内注射HSP27可导致青光眼样损伤。本研究旨在探讨间歇性禁食是否能保护视网膜免受此类损伤。
方法
采用CD1小鼠，向一眼玻璃体内注射HSP27，对侧眼作为对照。注射后将动物分为自由进食组（无禁食）和间歇性禁食组（每周一、三、五禁食24小时）。每周称重。4周后，通过光学相干断层扫描（OCT）分析视网膜厚度（n=7眼/组）。利用免疫组织化学分析视网膜神经节细胞（RGCs）、凋亡细胞、大胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-1β（IL-1β）（n=6眼/组）。通过RT-qPCR检测相应标志物（n=4样本/组）。此外，对禁食与非禁食小鼠的血清样本进行了微阵列分析（n=6样本/组）。
结果
体重和OCT测量显示组间无差异。与对照组相比，HSP27注射眼RGC数量显著减少，Rbpms mRNA水平降低，而HSP27+禁食组RGC数量与对照组相似。凋亡标志物未见差异。HSP27组织中大胶质细胞（GFAP+）面积增加，而HSP27+禁食组与对照组无差异。HSP27注射后小胶质细胞数量未改变，但在HSP27+禁食视网膜中数量较低。与对照组及HSP27组织相比，HSP27+禁食样本中Tnfa和Il1b表达水平下调。此外，禁食小鼠血清中多种促炎细胞因子（包括IL-1β和IL-6）水平低于非禁食组。
讨论
神经退行性疾病是重大的公共卫生挑战，目前仍缺乏有效的预防和疾病修饰疗法。对于青光眼，唯一获批的疗法是降低眼压，但这只能延缓而非治愈疾病。近年来，研究开始关注非药物方法在延缓青光眼进展中的作用，例如热量限制与神经退行性变的关系。本研究表明，在压力无关的、免疫诱导的青光眼损伤中，间歇性禁食首次显示出保护作用。前期工作表明，玻璃体内注射HSP27可在大鼠和小鼠中引起青光眼样损伤。HSP27通过其定位（细胞内或细胞外）和免疫微环境的激活状态，表现出调节炎症的双重能力。细胞内HSP27作为细胞保护性伴侣，可稳定细胞骨架、限制氧化应激并负向调节促炎信号通路（如NF-κB通路），有利于抗炎表型。相反，细胞外HSP27在细胞应激或坏死时释放，可作为损伤相关分子模式与单核细胞/巨噬细胞上的Toll样受体（TLR）2和TLR4结合，导致NF-κB激活及促炎和调节性细胞因子的产生。
本研究中，间歇性禁食未导致体重差异，这与之前对C57/BL6小鼠的研究结果一致，短期禁食可能不会引起显著体重变化，因为禁食组小鼠在进食日可能摄入更多食物。尽管体重无变化，但禁食对RGCs产生了保护作用。HSP27注射显著降低了RBPMS+细胞数量和Rbpms mRNA水平，而接受禁食的HSP27组则显示出与对照组相似的RGC数量和mRNA水平，表明间歇性禁食对这些神经元具有保护作用。这与缺乏谷氨酸转运体EAAC1的小鼠研究结果类似，相同的饮食方案能保护RGCs。在年轻和老年大鼠的缺血/再灌注损伤中，热量限制也能保护RGCs。甚至48小时的禁食也能显著减少急性高眼压诱导的RGC损失。
虽然RGC变性的确切机制尚未完全阐明，但已知细胞凋亡是青光眼中最早期的细胞损失形式。在本研究中，各组cleaved caspase 3+细胞数量相似，表明在此时间点，HSP27注射和禁食均未影响凋亡细胞。此外，HSP27和HSP27+禁食视网膜中Bax/Bcl2的mRNA表达比率也未改变。这可能是由于检查时间点较晚（注射后4周），而凋亡事件可能发生在更早阶段。在青光眼中，神经炎症过程常在疾病早期被观察到，如大胶质细胞和小胶质细胞活化以及促炎细胞因子增加。在HSP27诱导的青光眼模型中，小胶质细胞/巨噬细胞数量未见差异，但既往研究注意到Iba1和Tmem119 mRNA表达上调。本研究中也发现，HSP27注射本身不影响小胶质细胞的数量或激活状态。然而，在HSP27+禁食眼中观察到更少的小胶质细胞，表明饮食方案能够减轻炎症反应。类似结果在创伤性脑损伤研究中也有报道，损伤前的热量限制可抑制小胶质细胞活化。通常，小胶质细胞的激活先于青光眼损伤，因此本研究的时间点可能已过了小胶质细胞的活跃反应期。
已知小胶质细胞与T细胞相互作用。在人类中，辅助性T细胞1（Th1）和辅助性T细胞2（Th2）之间的失衡有助于促炎环境。在青光眼供体眼中已检测到CD3+T细胞。有趣的是，本研究中HSP27视网膜的CD3+T细胞数量最低，而大多数T细胞在对照组+禁食和HSP27+禁食样本中被检测到。其他研究表明，禁食可重塑T细胞代谢。例如，饮食限制通过增强糖皮质激素产生和抑制糖酵解来帮助调节T细胞能量平衡。此外，在老年小鼠中，饮食限制增强了初始T细胞的保存，有助于维持T细胞受体库的多样性，同时防止抗原呈递和T细胞增殖的下降。在罗非鱼中，短期禁食导致T细胞大小和CD3蛋白表达增加。作者认为，在缺乏抗原刺激的情况下，禁食可能在一定程度上诱导T细胞活化。本研究仅对视网膜切片中的CD3+T细胞进行了计数。未来的研究应采用更全面的方法（如流式细胞术）来更好地表征T细胞群体。此外，检查不同的T细胞亚型对于确定禁食是否促进向保护性表型转变非常重要。
热量限制的益处被认为涉及氧化应激和炎症的减少。因此，我们检测了视网膜和血清中的促炎标志物。很明显，间歇性禁食显著降低了所研究的细胞因子。尽管各组TNFα+细胞数量相似，但对照组+禁食以及HSP27+禁食视网膜中Tnfa mRNA表达水平较低。TNFα是小胶质细胞产生的细胞因子之一。在原发性开角型青光眼患者的房水和血清样本中，观察到TNFα水平升高。在本研究中，间歇性禁食降低了对照组和HSP27视网膜中的Tnfa水平。这与对健康人的研究结果一致，热量限制也降低了循环TNFα水平。IL-1β是另一种促炎细胞因子，主要由髓系炎症细胞以前体形式（pro-IL-1β）产生。当炎症细胞暴露于病原体相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP）时，可迅速诱导pro-IL-1β，这些模式与模式识别受体结合上调促炎基因表达。例如，炎症小体的激活导致pro-IL-1β成熟为可分泌的形式。在正常眼压实验性自身免疫性青光眼模型中，我们先前观察到大鼠房水中IL-1β水平升高。玻璃体内注射HSP27后也注意到Il1b mRNA水平上调。本研究证实了这一点，我们不仅发现Il1b mRNA水平上调，而且HSP27注射眼的IL-1β+染色面积增加。然而，HSP27+禁食组在IL-1β+染色面积上未见变化。此外，与对照组和HSP27视网膜相比，HSP27+禁食视网膜中Il1b mRNA表达水平显著下调。额外的微阵列分析显示，接受间歇性禁食的小鼠血清IL-1β水平较低。同时，禁食小鼠血清中IL-4、IL-6、MIP-1α和M-CSF水平也降低。在患有代谢综合征的肥胖人群中，为期6个月的平衡低热量饮食导致体重减轻，并伴随血清促炎细胞因子（如IL-6、TNFα、IL-8和MIP-1β）的减少。总之，我们的结果表明，间歇性禁食等非药物干预可以有效地补充现有的青光眼疗法。
我们认识到禁食与自噬有关，自噬是一种清除受损蛋白质和细胞器并支持代谢适应性的细胞通路。自噬在RGC健康中扮演双重角色。在生理或中等应激条件下，它有助于清除受损的细胞器和蛋白质，支持RGC存活。相反，失调或过度的自噬可能导致RGC死亡。在各种实验性青光眼和视神经损伤模型中，改变的自噬标志物（如LC3、p62或线粒体自噬调节因子）和受损的自噬流与进行性RGC丢失相关。已知上游调节因子（包括mTOR、AMPK和线粒体自噬相关通路）的平衡决定了自噬是保护性的还是有害的。调节自噬可能是保护青光眼变性中RGCs的一种有前景的策略。例如，最近的研究强调了自噬调节干预在青光眼中的潜在神经保护作用。研究表明，二甲双胍在视网膜缺血/再灌注小鼠模型中保护RGCs，并伴随自噬和线粒体自噬信号增加。此外，接受二甲双胍治疗的糖尿病性青光眼患者在6个月内比胰岛素治疗的对照组表现出更稳定的视野。这些发现支持二甲双胍作为一种通过代谢和自噬相关通路起作用的神经保护剂，从而模拟禁食效应。一项最近的流行病学分析检查了间歇性禁食（反复不吃早餐）与青光眼的影响。在这项回顾性横断面研究中，结果与青光眼患病率和禁食没有显著关联。然而，必须指出，数据基于参与者的自我报告，并且不吃早餐并不完全等同于间歇性禁食。总之，这些发现表明，虽然代谢或药理学诱导自噬可能具有治疗前景，但需要进行仔细控制的机制和临床研究，以确定如何最好地利用自噬进行青光眼神经保护。
结论
总之，我们的研究结果强调了间歇性禁食在压力无关、免疫介导的青光眼模型中的神经保护和抗炎潜力。尽管没有显著的体重减轻，但饮食限制有效地保护了RGCs，并降低了视网膜和全身的促炎细胞因子水平。虽然确切的分子机制仍有待阐明，但神经炎症的调节似乎起着关键作用。这些数据共同支持了越来越多的证据，表明代谢和生活方式因素可能关键性地影响像青光眼这样的神经退行性眼病的进展和管理。
