《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Single-cell RNA sequencing revealed cell heterogeneity in sagittal suture mesenchyme
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本研究通过整合10x Genomics与Smart-seq3单细胞转录组测序技术，首次在矢状缝间充质中鉴定出具有快速增殖、短暂存在特征的过渡放大细胞（Transit-amplifying cells, TACs），并揭示了其作为缝间充质干/基质细胞（Suture Mesenchymal Stem/Stromal Cells, SuSCs）的直接后代，在颅骨快速发育中的关键作用及由Erg和E2f7/8分别调控的核心信号网络，为理解颅缝形成和稳态维持提供了新的细胞和分子框架。
技术策略与细胞图谱构建
为克服颅缝组织细胞量少、捕获难度大的挑战，本研究创新性地结合了10x Genomics高通量单细胞转录组测序和具有更高测序深度的Smart-seq3技术，对出生后第7天（PN7）小鼠矢状缝间充质细胞进行了系统分析。Smart-seq3在目标细胞（此处为Gli1-CreERT2;tdTomato阳性细胞）的捕获效率和测序深度（平均每个细胞检测到的基因数和总读数）上均优于10x Genomics，为后续精细的细胞亚群鉴定和分化状态分析奠定了坚实基础。通过生物信息学分析，研究团队成功构建了矢状缝间充质细胞的单细胞图谱，鉴定出包括缝间充质干/基质细胞（SuSCs）、增殖细胞（Proliferating cells）、前成骨细胞（Pre-osteoblast）、成骨细胞（Osteoblast）、软骨样细胞（Chondrogenic-like cell）、颅内膜细胞（Endocranial cell）和颅外膜细胞（Ectocranial cell）在内的多个细胞亚群。
SuSCs特征与分化轨迹
研究确认SuSCs高表达Hhip、Six2、Axin2等已知标志物。通过CytoTRACE2分析评估各细胞群的分化状态，结果显示从SuSCs、增殖细胞到前成骨细胞、成骨细胞，分化程度逐渐升高。Smart-seq3数据进一步提示，颅内/外膜细胞的分化状态介于SuSCs/增殖细胞与前成骨细胞之间。空间转录组学分析及RNA原位杂交验证发现，Sfrp2（分泌型卷曲相关蛋白2）和Mfap4（微纤维相关蛋白4）的转录本在PN7和PN28小鼠的矢状缝中心区域SuSCs中特异性高表达，而在成骨细胞中不表达，提示它们可能参与SuSCs干性的维持而非成骨分化。
首次鉴定颅缝TACs及其特性
研究通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）增殖实验、Ki67免疫荧光染色及Mki67 mRNA原位杂交，发现矢状缝中存在一群快速增殖的细胞，主要分布在缝间充质中心区两侧。EdU脉冲追踪实验显示，该群细胞在注射后2-4小时比例最高（约10-15%），随后迅速下降，至8-12小时已显著减少，体现了其“短暂存在”的特性。进一步利用Ki67-CreERT2;tdTomato小鼠进行谱系追踪，发现被标记的增殖细胞后代在PN9时广泛分布于缝间充质、颅内/外膜区域及部分成熟骨组织中；随着发育进行（PN14至PN28），缝间充质中的tdTomato阳性细胞逐渐减少，而顶骨中的数量持续增加，并出现与成骨细胞标志物Sp7共标的细胞。这些证据共同表明，这群增殖细胞具有快速增殖、低自我更新能力、能够分化为成骨细胞及颅内/外膜细胞的特征，符合过渡放大细胞（TACs）的定义，是SuSCs的直接后代，负责为颅骨结构的快速发育提供细胞来源。
关键转录因子调控网络解析
运用SCENIC分析筛选各细胞亚群的关键转录因子。结果显示，ETS转录因子家族成员Erg在SuSCs中特异性高表达，其下游靶基因富集于间充质干细胞分化、骨骼系统形态发生等生物学过程，如参与Hedgehog信号通路的Hhip、TGF-β信号通路的Tgfb3、Notch信号通路的配体Jag1等。此外，研究还发现Cpxm2和Bhlhe41等新型基因在SuSCs中特异性表达。在增殖细胞（即TACs）中，E2F转录因子家族成员E2f7和E2f8的调节子（regulon）活性显著升高，其下游靶基因主要参与细胞周期、DNA复制等过程，表明E2f7/8是调控TACs快速扩增的关键因子。
研究意义与展望
该研究首次在发育中的颅缝生态位中鉴定出TACs的存在，揭示了SuSCs通过产生TACs进行快速细胞扩增，进而支持颅缝形成和稳态维持的“静息-增殖-分化”层级调控新模式。对SuSCs关键调控因子Erg及其下游网络，以及TACs特征性因子E2f7/8的揭示，为深入理解颅缝发育的分子机制提供了重要线索。不仅为颅缝早闭等疾病的病因学研究提供了新的视角，也为基于组织驻留干细胞/祖细胞的颅骨再生修复策略开发奠定了理论基础。两种单细胞测序技术的互补应用策略，也为研究其他稀有细胞群体提供了方法学参考。
