《Frontiers in Plant Science》：Transcriptomic and targeted metabolomic insights into carotenoid-mediated color formation in sorghum grains
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本研究通过整合转录组与靶向代谢组学分析，系统阐明了五种颜色高粱籽粒中类胡萝卜素积累的分子调控机制。研究发现黄色籽粒总类胡萝卜素含量最高（16.80±0.61 μg/g），并鉴定出PDS（15-顺式-八氢番茄红素脱氢酶）和CYP716A1（细胞色素P450 716A1）作为调控β-胡萝卜素、叶黄素和玉米黄质积累的关键基因。该研究为高粱类胡萝卜素生物强化育种提供了重要靶点。
引言
维生素A缺乏症（VAD）是全球范围内最普遍且严重的微量营养素缺乏症之一，在发展中国家影响尤为广泛。据统计，全球有超过2.5亿学龄前儿童和数百万育龄妇女受到VAD的影响。VAD不仅导致夜盲症和免疫功能受损，严重时还可能危及生命。这一问题在以谷物为主食的地区尤其突出，因为谷物中天然维生素A前体（类胡萝卜素）的水平普遍较低，不足以满足人体的营养需求。
高粱作为半干旱地区的核心粗粮作物，在保障撒哈拉以南非洲和南亚的粮食安全方面发挥着至关重要的作用。然而，普通高粱品种的类胡萝卜素含量相对较低。通过遗传改良增强高粱籽粒中具有维生素A活性的类胡萝卜素（如β-胡萝卜素和β-隐黄质）的积累，不仅能为当地居民提供可持续的维生素A来源，还能改善高粱的营养品质，这对于改善这些地区的公众健康具有重要的现实意义。
高粱籽粒呈现出丰富的颜色多样性，包括白色、黄色、红色、棕色和黑色表型。这些颜色差异主要由色素化合物的类型和含量决定。类胡萝卜素是黄色和橙色籽粒的核心色素，而酚类物质如花青素和单宁则主导了红色和棕色籽粒的着色。尽管先前研究已证实高粱籽粒颜色与类胡萝卜素含量之间存在关联，但类胡萝卜素生物合成和积累的机制尚未得到系统阐明。不同颜色高粱籽粒中类胡萝卜素的具体组成和含量差异尚未得到系统量化，特别是具有维生素A活性的类胡萝卜素在不同颜色籽粒中的分布模式仍不清楚，导致这些差异的内在分子调控机制仍处于零散的研究阶段。这些因素极大地限制了通过分子育种精确提高高粱类胡萝卜素含量的效率。
类胡萝卜素生物合成是一个复杂的多步骤代谢过程。在植物中，它由质体中一系列核基因编码的酶催化，该过程受到多个基因的协同调控。目前，仅有少数关键基因，如PSY（八氢番茄红素合酶）和ZEP（玉米黄质环氧化酶），被初步认为与高粱籽粒中的类胡萝卜素合成有关。高粱籽粒中参与类胡萝卜素生物合成的基因在籽粒发育过程中表现出动态的表达模式。大多数类胡萝卜素合成基因在籽粒发育早期（授粉后14天）高表达，而类胡萝卜素降解基因和一些分支点基因在发育后期表达较高。研究发现，该途径的调控涉及多个层面，包括转录水平（关键酶基因的表达）、转录后水平（酶活性的修饰）和代谢通量分布（分支酶之间的竞争）。然而，单一的组学技术不足以完全揭示其调控网络。结合类胡萝卜素靶向代谢组学和转录组学的整合分析策略已成为解析植物次生代谢物生物合成机制的主流方法，为阐明复杂的代谢网络提供了系统视角。
本研究旨在系统阐明不同颜色高粱籽粒中类胡萝卜素积累差异的代谢和转录调控基础。采用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术对不同颜色籽粒中类胡萝卜素的组成和分布进行定量分析。结合RNA-seq（RNA测序）筛选类胡萝卜素生物合成途径中的差异表达基因（DEGs）。进一步，进行类胡萝卜素靶向代谢组和转录组的整合分析，构建核心调控模块，并深入分析关键基因的功能。该研究不仅填补了不同颜色高粱籽粒类胡萝卜素调控机制的研究空白，而且为高粱类胡萝卜素生物强化育种提供了关键基因标记和理论基础，对于协同提高作物营养品质和外观品质、缓解维生素A缺乏问题具有重要意义。
材料与方法
实验材料
本研究使用的粒用高粱品种包括白色籽粒的BTx623（W）、灰色籽粒的P898012（G）、黄色籽粒的Tx430（Y）、红色籽粒的HYZ（R）和黑色籽粒的BYQ（B），均由贵州省农业科学院旱粮研究所收集和保存。这些品种在该研究所的实验基地（坐标26°40’14”N, 106°37’20”E）进行栽培。所有材料均按照标准农艺实践进行管理，包括施肥、灌溉和除草。为确保种子纯度，在每个品种开花前选择三个均匀的穗，使用硫酸纸袋进行套袋自花授粉。收获后，籽粒样品立即在液氮中冷冻，以瞬时停止所有生物活性并保存代谢物和转录本的体内状态。冷冻样品随后保存在-80°C直至进一步分析。
类胡萝卜素提取与测定
类胡萝卜素提取方法参考Ma等人（2017）的方法。将保存在-80°C的成熟高粱种子使用组织研磨机（30 Hz，1分钟）研磨成细粉。每个样品分析三个生物学重复，每个生物学重复测量一次。取0.05克粉末转移至离心管中，加入0.5 mL含有0.01% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）的溶剂混合物（正己烷/丙酮/乙醇，1:1:1, v/v/v）。在室温下涡旋20分钟，随后在4°C下以12,000 rpm离心5分钟。小心地将上清液转移至新的离心管中。向原管中再次加入等体积的提取溶液，重复提取过程。将两次提取的上清液合并。随后使用真空浓缩仪将沉淀浓缩至干，并用100 μL甲醇/甲基叔丁基醚（1:1, v/v）的混合溶液复溶。经0.22 μm膜过滤器过滤后，样品储存于棕色样品瓶中进行UPLC-MS/MS分析。
类胡萝卜素使用超高效液相色谱（ExionLC? AD）与串联质谱（QTRAP?6500+）联用（UPLC-MS/MS）进行定量，方法依据Krinsky等人（2004）和Geyer等人（2004）报道的方法。采用YMC C30色谱柱进行液相分析，进样体积为2 μL。二元流动相包括含有0.01% BHT和0.01%甲酸的甲醇/乙腈（1:3, v/v）（A相）以及含有0.01% BHT的甲基叔丁基醚（B相）。线性洗脱梯度程序如下：0分钟，100% A；3分钟，100% A；5分钟，30% A + 70% B；9分钟，5% A + 95% B；10分钟，100% A；11分钟，100% A。流速保持在0.8 mL/min，柱温设置为28°C。质谱条件包括350°C的大气压化学电离（APCI）源和25 psi的帘气压力。用于类胡萝卜素鉴定和定量的所有标准品，如α-胡萝卜素、番茄红素、γ-胡萝卜素，均购自Sigma-Aldrich。使用这些标准品建立了代谢物数据库，以促进质谱检测数据的定性分析。定量策略：1）完全定量：对于具有市售标准品的类胡萝卜素（如β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质），进行了完整的方法验证，包括测定定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）。2）半定量：对于缺乏商业标准的类胡萝卜素衍生物（如酰化叶黄素），采用半定量方法。该方法利用最接近结构类似物的校准曲线，这是比较类胡萝卜素靶向代谢组学中成熟的做法。此外，使用三重四极杆质谱的多反应监测（MRM）模式绘制标准曲线，以定量检测到的代谢物浓度。
RNA提取与基因表达分析
收集五个高粱品种的成熟籽粒样品（花后30天），每个样品三个生物学重复。随后，使用NEBNext?Ultra? RNA文库构建试剂盒构建转录组文库。经过质量评估后，在NovaSeq 6000平台上使用双末端测序策略进行测序。测序数据通过Trimmomatic软件进行质量控制以去除接头，得到的干净数据比对至红缨子参考基因组。使用Cufflinks软件定量评估基因表达水平，并以FPKM（每百万映射读取的每千碱基转录本片段数）表示。使用DESeq2 v1.22.1软件包对不同颜色高粱籽粒的成对比较中鉴定并分析类胡萝卜素合成途径中涉及的差异表达基因（DEGs）。DEG筛选标准包括错误发现率（FDR）< 0.05且绝对log2倍数变化≥ 1。鉴定出的DEGs进一步进行KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析。为了研究与类胡萝卜素积累特异性相关的转录变化，将所有品种与表现出最低类胡萝卜素含量的材料HYZ进行比较。该品种作为生物学基线，允许在其他品种中识别随着类胡萝卜素水平升高而激活的DEGs和代谢通路。这种比较策略增强了检测类胡萝卜素相关转录调控的灵敏度，同时减少了其他色素类别的干扰。
整合代谢组与转录组分析
利用超几何检验进行富集分析，以KEGG数据库中的通路作为分析单元。该检验用于识别与整个基因组背景相比，差异表达代谢物和基因中显著富集的通路。使用所有样品中基因和代谢物的定量值进行相关性分析。使用R中的cor函数计算基因和代谢物之间的皮尔逊相关系数。选择相关系数大于0.80且p值小于0.05的差异表达基因和代谢物进行进一步分析。
结果
高粱籽粒类胡萝卜素靶向代谢组学分析
五种颜色籽粒类胡萝卜素含量的多样性分析
为了阐明五种不同颜色高粱籽粒中的类胡萝卜素含量和组成，我们采用UPLC-MS/MS测定了这些参数。UPLC-MS/MS方法对每种类胡萝卜素标准品进行了严格验证。建立了具有适当权重（1/x2）的校准曲线，所有曲线均显示出优异的线性（r > 0.99）。测定了每种化合物的定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）。相关性分析显示，同一品种生物学重复之间的相关系数超过0.9，表明生物学重复之间具有高度重现性。此外，主成分分析（PCA）识别出不同颜色高粱籽粒样品之间的显著变异。
对五个高粱品种的综合分析揭示了31种类胡萝卜素的存在，它们是类胡萝卜素生物合成途径的中间体。其中，三类被归类为胡萝卜素，其余29种被鉴定为叶黄素。在不同高粱品种之间观察到类胡萝卜素的组成和总含量均存在显著差异。在品种中，Y检测到的类胡萝卜素组分数量最多，总计33种。其次是品种W和R（HYZ），各有26种组分，品种B有25种组分。G品种检测到的组分最少，仅有22种。值得注意的是，其中20种类胡萝卜素在所有五个品种中均被一致检测到。七种独特的类胡萝卜素仅在Y品种中被鉴定出来，包括玉米黄质-肉豆蔻酸-棕榈酸酯、玉米黄质-月桂酸-肉豆蔻酸酯、玉米黄质二月桂酸酯、α-隐黄质、叶黄素二油酸酯、紫黄质-肉豆蔻酸-月桂酸酯和紫黄质二肉豆蔻酸酯。此外，两种类胡萝卜素，?-胡萝卜素和辣椒红素，仅在R品种中检测到，而玉米黄质肉豆蔻酸酯在W品种中被独特鉴定。
不同颜色高粱品系之间的类胡萝卜素种类含量存在显著差异（p < 0.05）。值得注意的是，对于某些丰度极低的类胡萝卜素（例如，海胆酮），其浓度低于LLOQ。虽然这些化合物的绝对定量值应谨慎解释，但它们在生物学重复中的一致性检测允许可靠地评估它们在高粱品种间的相对差异，这是本研究的主要重点。黄色品系（Y）表现出最高的总类胡萝卜素含量，为16.8020 ± 0.6077 μg/g，显著高于其他四个品系。其次是白色品系（W）（8.2928 ± 0.0449 μg/g）、黑色品系（B）（5.6859 ± 0.4621 μg/g）和灰色品系（G）（4.5856 ± 0.1905 μg/g）。红色R品系的类胡萝卜素含量最低，为3.7987 ± 0.3748 μg/g。叶黄素是所有品系中主要的类胡萝卜素，在W、G、Y、R和B中分别占总类胡萝卜素的52.34%、51.12%、40.15%、50.23%和46.00%。这些发现表明，类胡萝卜素含量并非白色、灰色、红色和黑色高粱籽粒颜色的主要决定因素，尽管在黄色籽粒中含量最高。
五种颜色籽粒差异类胡萝卜素代谢物分析
通过对呈现多种颜色的高粱品系进行全面的类胡萝卜素靶向代谢组学分析，我们根据变量重要性投影（VIP）≥ 1、Fold_Change ≥ 2或Fold_Change ≤ 0.5的筛选标准，鉴定了显著上调和下调的代谢物。值得注意的是，在五种不同颜色的样品中未观察到共同的差异类胡萝卜素代谢物。与类胡萝卜素含量最低的R品系相比，W和R之间鉴定出20种差异代谢物，其中15种上调和5种下调，主要富集在5条KEGG通路中。G和R之间鉴定出16种差异代谢物，其中12种上调和4种下调，富集在4条KEGG通路中。Y和R品系表现出最多的差异代谢物，总计32种，其中27种上调和5种下调，主要富集在5条KEGG通路中。相反，B和R之间的差异代谢物数量最少，为13种，包括9种上调和4种下调，富集在4条KEGG通路中。在这些比较中，鉴定出8种共同的差异代谢物。
五种颜色籽粒的转录组学分析
转录组谱概览及差异表达分析
为了探索高粱籽粒的转录谱，在花后30天为每个五种高粱籽粒颜色变体的三个生物学重复构建了cDNA文库，以促进转录组测序。相关性分析显示，同一品种生物学重复之间的相关系数超过0.9，表明具有高度重现性。此外，主成分分析（PCA）显示样品组之间存在显著分化，表明不同颜色高粱籽粒之间存在显著的转录差异。转录组测序每个样品产生超过4.28 Gb的干净读数，最终总计786,212,722条干净读数和117.92 Gb的总碱基对。高粱籽粒的GC含量在56.34%至59.15%之间，Q30碱基百分比超过91.25%。总之，这些发现证实测序数据的数量和质量足以进行后续分析。去除接头序列和低质量读数后，将每个文库的干净读段比对至参考基因组（HYZ基因组）。该过程共鉴定出44,897个基因，以及12,229个未在参考基因集中注释的新转录本。
基于|log2倍数变化| ≥ 1且FDR < 0.05的标准，五个品种之间的成对比较共鉴定出14,180个差异表达基因（DEGs）。在这些比较中，WvsR组表现出最多的DEGs（7,254个），包括3,343个上调和3,911个下调的DEGs。G和R之间有6,092个DEGs，其中2,771个上调和3,321个下调。而Y vs R比较产生6,074个DEGs，包括3,286个上调和2,788个下调。在B vs R中观察到的DEGs数量最少，为5,474个，其中3,019个上调和2,455个下调。这些结果表明，白色籽粒和红色籽粒之间的DEGs数量最为显著。维恩图分析在所有四个组合组的DEGs中鉴定出254个共同基因。KEGG通路富集分析显示，来自W vs R、G vs R、Y vs R和B vs R比较的DEGs分别与134、139、138和137条KEGG通路相关。
对鉴定出的DEGs进行K均值聚类分析，以根据相似的变异趋势对其进行分类。最终，14,180个DEGs被分为四个不同的亚类，在不同样品中表现出差异表达。通过分析这些亚类内基因表达模式与类胡萝卜素含量变化之间的相关性，选择第4亚类中的基因进行进一步研究，以识别那些参与类胡萝卜素合成调控的基因。结果显示，第4亚类中的九个基因富集在类胡萝卜素生物合成途径中，这些基因包括：SbiHYZ.01G521800（3-单加氧酶）、SbiHYZ.02G100700（黄嘌呤脱氢酶）、SbiHYZ.02G219200（脱落酸8'-羟化酶3）、SbiHYZ.02G359000（Momilactone A合酶）、SbiHYZ.02G381700（15-顺式-八氢番茄红素脱氢酶）、SbiHYZ.04G282900（脱落酸8'-羟化酶1）、SbiHYZ.07G155800（脱落酸8'-羟化酶3）、SbiHYZ.08G124900（细胞色素P450 716A1）和SbiHYZ.08G175300（9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED5）。其中，15-顺式-八氢番茄红素脱氢酶催化将八氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素的关键脱氢步骤，这对于下游类胡萝卜素的形成至关重要。细胞色素P450 716A1和3-单加氧酶参与氧化修饰步骤，有助于类胡萝卜素衍生物的结构多样化。黄嘌呤脱氢酶可能参与氧化应激反应，间接影响类胡萝卜素的稳定性。值得注意的是，三个脱落酸8′-羟化酶（由SbiHYZ.02G219200、SbiHYZ.04G282900和SbiHYZ.07G155800编码）和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶NCED5（SbiHYZ.08G175300）在类胡萝卜素降解为脱落酸（ABA）的过程中发挥关键作用，将类胡萝卜素代谢与激素生物合成联系起来。Momilactone A合酶可能参与二萜和类胡萝卜素途径的分支。总之，这些基因表明类胡萝卜素生物合成和分解代谢之间存在协同调控，可能有助于高粱籽粒中类胡萝卜素诱导的颜色差异。分析了八个基因在五种不同颜色高粱籽粒中的表达水平。值得注意的是，SbiHYZ.07G155800的表达水平在所有样品中均持续较高，并且所有八个基因在灰色高粱籽粒G中均表现出表达升高。
不同颜色高粱籽粒类胡萝卜素代谢相关基因的表达谱
高粱籽粒类胡萝卜素含量的差异受类胡萝卜素生物合成和降解关键基因表达的调控。为了进一步阐明类胡萝卜素变异的分子机制，我们分析了与类胡萝卜素代谢相关的基因表达谱，包括上游的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径以及下游的生物合成和降解途径。结果显示，多个关键基因在白色（W）、灰色（G）、黄色（Y）、红色（R）和黑色（B）高粱品种中表现出不同的表达模式，表明类胡萝卜素代谢的差异转录调控可能导致籽粒颜色的多样性。
在上游MEP途径中，参与前体合成的基因，如DXS（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶）和GGPPS（香叶基香叶基焦磷酸合酶），在黄色籽粒中的表达水平高于浅色籽粒（W和G）。这些基因表达升高可能增强了类胡萝卜素前体的产生，为下游色素生物合成提供了充足的底物。在核心类胡萝卜素生物合成途径中，PSY（八氢番茄红素合酶）基因家族的成员，特别是PSY1和PSY2，在红色和黑色籽粒中显著上调。由于PSY是类胡萝卜素生物合成中的限速酶，其表达增加通常与色素积累增强相关。此外，催化八氢番茄红素转化为番茄红素的PDS（八氢番茄红素脱氢酶）在黄色籽粒中的表达高于浅色品种，表明有色类胡萝卜素中间体的合成更有效。在三个同源基因PDS1、PDS2和PDS3中，PDS2（SbiHYZ.02G381700）表现出最显著的差异表达。这些发现表明，PDS2主要导致高粱籽粒细胞类胡萝卜素积累的差异。关于类胡萝卜素的修饰和降解，BCH（β-胡萝卜素羟化酶）在黄色和红色籽粒中表达更高，表明β-胡萝卜素向玉米黄质的转化更活跃。类似地，降解相关基因，如ZEP（玉米黄质环氧化酶）和NCED（9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶），在黄色和红色籽粒中显示出升高的转录水平，意味着向叶黄素衍生物（如紫黄质）和脱辅基类胡萝卜素的代谢通量增强。这些结果表明，除了合成能力的差异外，类胡萝卜素途径的分支和周转在高粱品种间也存在差异。需要注意的是，高粱籽粒颜色并非仅由类胡萝卜素决定，还受到其他色素如花青素和酚类化合物的影响。因此，本研究中鉴定出的类胡萝卜素相关基因的差异表达是导致高粱籽粒颜色多样性的一个重要但非
