《Frontiers in Plant Science》：Alterations in microhabitat can impact litter decomposition by modifying the litter C/N ratio and regulating soil microbial activity
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本综述系统阐述了极端干旱条件下，微生境改变如何通过调控凋落物碳氮比（C/N）和土壤微生物群落（如放线菌门Actinobacteria、子囊菌门Ascomycota）来影响凋落物分解过程。研究揭示了植被覆盖与沙埋处理对凋落物质量（木质素、C/N）、微生物多样性（α-diversity）及分解速率（k）的交互作用，强调了光降解（photodegradation）在无植被区的关键驱动角色，为理解干旱生态系统碳（C）氮（N）循环提供了重要的机制见解。
引言
凋落物分解是将陆地生态系统碳（C）输送到大气中的关键过程，约占全球年碳通量的70%。鉴于干旱区覆盖地球陆地表面的45%以上，其分解动态在全球碳循环中扮演重要角色。在干旱生态系统中，凋落物分解受到独特环境约束的塑造，包括有限的降水、强烈的太阳辐射和不稳定的土壤结构，这些条件与非干旱环境显著不同。然而，大多数凋落物分解研究集中在湿润和半湿润生态系统，而对干旱生态系统的研究仍然有限。特别是在变化的干旱环境下，干旱生态系统中凋落物分解的动态和机制仍知之甚少。因此，研究凋落物分解过程对干旱生境变化的响应机制，可以增强我们对生态系统内养分循环的理解，并有助于更准确地预测未来陆地生态系统的碳动态。
凋落物分解速率主要由环境因素、凋落物质量和土壤微生物群落之间的协同相互作用决定。在大的空间尺度上，环境因素——包括温度、湿度和土壤pH值——被广泛认为是凋落物分解的主要驱动因素。研究表明，变暖可以通过直接改变土壤湿度和温度来间接影响微生物活动及其介导的生态过程，如凋落物分解，进而影响微生物生长和代谢所需的碳源和能量的可用性。此外，在对降水敏感的干旱生态系统中，增加的降水可以增强微生物分解，同时抑制光降解。相反，降水也可能加剧凋落物中化合物的淋溶，从而增加其对光降解的敏感性。土壤pH值通过影响养分的化学形态和其生物有效性，进一步间接影响分解速率。此外，人类活动，如氮和酸沉降，对分解过程施加了额外的影响，从而使其进一步复杂化。尽管如此，我们对干旱地区环境变化如何影响土壤微生物，进而影响凋落物分解的理解仍然有限。这种不确定性阻碍了我们评估不同微环境在调节分解过程中的作用的能力，并限制了对这些生态系统中碳循环的准确评估。
先前关于凋落物分解的研究主要强调了特定环境背景下的凋落物质量和土壤微生物，关于分解动态如何随不同生境类型变化的知识相对较少。研究表明，在典型的草甸生态系统中，有利的环境条件，如较高的温度、较低的湿度和较低的C/N比，强烈促进凋落物分解。相比之下，具有高C/N比的凋落物分解更慢，与分解速率表现出更强的负相关。在温度和湿度较低的沼泽草甸，分解速度较慢，与C/N比的相关性较弱。这些发现表明，环境条件可能比凋落物化学性质（如C/N比或木质素含量）对分解施加更强的影响。在干旱生态系统中，研究表明凋落物的养分释放与其结构组成和化学计量特征（例如，总C/N和C/P比）密切相关，并且环境条件可以改变释放过程。在各种生态系统中，研究表明凋落物分解速率对凋落物性状变化的响应因生态系统类型和土壤特征而异。在干旱地区，土壤水分和养分的限制在植被区和非植被区之间形成了鲜明对比。此外，无植被景观中频繁的沙尘暴可以将凋落物分散到广阔区域，给分解动态带来变异性。然而，这种变异性的驱动因素仍然知之甚少。因此，需要进行全面的研究来阐明干旱地区凋落物分解如何响应变化的环境条件，这些知识对于提高旱地生态系统生物地球化学模型的准确性至关重要。
迄今为止，有限的研究考察了不同立地条件下的凋落物分解，大多数研究主要集中在地表土壤。然而，不同深度土壤性质的变化表明，土壤层可能对凋落物分解有不同的响应。在极端干旱地区，土壤养分有效性低，有机质含量极低。频繁的风活动导致局部沙丘移动和凋落物埋藏，使得沙埋成为这些生态系统中的常见现象。沙埋通过降低光强度和土壤温度，同时增加土壤湿度，引入了复杂的微环境变化。这些环境变化可能显著影响凋落物质量损失。一些研究表明，在干旱生态系统中，沙埋后改善的温度和湿度条件可以增强微生物活性，并加速凋落物的降解，与地表暴露的凋落物相比。然而，在极端干旱条件下的研究表明，地表凋落物分解也可能很快。这可能是由于“直接光解”的结果，强烈的太阳辐射分解了顽固化合物，如木质素和半纤维素，促进了后续的微生物分解。值得注意的是，有研究报告称埋藏处理之间的凋落物质量损失没有显著差异，可能是因为这些处理没有暴露于辐射，导致分解速率低且变异最小。因此，不同土壤中的微生物如何响应不同的微生境，以及这些相互作用如何影响凋落物分解，仍然知之甚少。需要进一步的研究来阐明驱动这些过程的潜在机制。
材料与方法
本研究在极端干旱的生态系统中进行了一项为期一年的凋落物分解研究，旨在研究凋落物性质和土壤微生物群落响应微环境变化如何影响凋落物分解的机制。我们检验了以下假设：1）在极端环境条件下，微环境变异是影响凋落物质量损失、C/N比以及木质素释放或固定的主要驱动因素；2）在植被和非植被生境中，土壤微生物在15厘米深度埋藏时对凋落物分解起关键作用；3）在裸露沙土表面，光降解驱动的木质素分解是加速凋落物分解的主要机制。
研究地点位于策勒荒漠草地生态系统国家野外科学观测研究站。该地区海拔约1300米，属于典型的大陆性干旱气候，水资源极其有限。年平均降水量约为42.6毫米，而年蒸发量超过2600毫米。极端温度范围从-23.9°C到41.9°C。主要土壤类型为沙土，有机质含量低，约为0.8%。主导景观为风成沙地，植被稀疏，主要组成物种为花花柴、骆驼刺、胡杨和沙拐枣。
凋落物收集与实验设计选择骆驼刺的叶片进行凋落物收集。在2021年10月上旬至中旬，将收集篮置于植物冠层下收集新鲜凋落叶。收集后，将凋落物充分混合，去除杂质，并在75°C下烘干48小时。2021年10月25日，使用精度为0.01克的电子天平称取约15克干燥凋落物，密封入15×15厘米的尼龙网袋（孔径1毫米）。保留三个样品用于分析初始凋落物的C、N、C/N比、木质素含量和木质素/N比。
实验地点位于绿洲和沙漠之间的过渡带。建立了两种不同的生境类型：一个无植被区和一个以骆驼刺为主的植被区。2021年10月31日，将凋落物袋布设在两种生境中的两个深度：土壤表面和埋藏15厘米深，以模拟自然分解过程。用钉子固定袋子以防止位移。从每个生境采集六次凋落物样品，每个处理五个重复。每个采样样方大小为50×50厘米，间隔1米，实验共使用了120个凋落物袋。
凋落物和土壤样品收集在分解过程的第5、7、8、10、11和12个月进行采样。每月采样20个凋落物分解网袋。研究测量了分解后C、N、木质素的含量以及C/N和木质素/N的比率。此外，还评估了凋落物质量损失和分解速率。使用碳氮元素分析仪测定凋落物和土壤中的总碳（TC）和总氮（TN）。使用纤维素分析仪分析木质素含量。
12月，戴着手套从凋落物袋表面收集土壤样品。从分解袋邻近区域（距离袋边缘1-2厘米的外围区域）提取微生物DNA，不包括袋内物质。为确保生物重复间的空间独立性，采样点至少间隔50厘米，以尽量减少水、养分或微生物扩散造成的潜在交叉污染。每个重复与一个独立布设的凋落物袋及其周围土壤基质相关联。采样顺序随机化以避免系统程序偏差。在每个采样单元内，围绕袋子均匀采集子样品（例如，在四个主要方向）并合并为一个复合样品，以增强代表性和减少局部变异性。每次从样地回收20个凋落物袋，并立即放入冰盒中运回实验室。用干净的刷子轻轻刷掉每个袋子表面的土壤，转移到1.5毫升离心管中。每个处理三个重复，标记并在-20°C下保存。所有样品在一周内使用干冰运送到测序机构。
使用OMEGA Soil DNA Kit提取DNA。初步定量和DNA纯度评估使用NanoDrop分光光度法进行，随后使用Qubit荧光法进行精确浓度测量。样品需满足以下质量标准：OD260/280比值在1.8至2.0之间，OD260/230比值大于1.8，DNA浓度至少为10 ng/μL。未达到这些阈值的样品进行重新提取或浓缩，以确保下游应用有足够的质量和数量。使用引物338F和806R扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区，产生约468 bp的扩增子。使用引物ITS5和ITS2扩增真菌ITS1区，产生长度通常为300至400 bp的片段。PCR反应在25 μL体系中进行，包含模板DNA、引物、dNTPs、高保真DNA聚合酶和相应缓冲液。热循环条件包括：95°C初始变性5分钟；随后30个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸45秒；最后72°C延伸5分钟，然后保持在12°C。为监控潜在污染，每个PCR批次包含一个无模板阴性对照（NTC），用无菌水代替DNA模板以检测试剂或操作过程中的外源污染。此外，在选定的批次中，将Mock Community（包含已知比例的标准细菌菌株基因组DNA的确定混合物）与样品一起扩增，以评估测序和生物信息学流程的准确性和潜在偏差。所有PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增特异性和片段大小，然后使用磁珠纯化，并等摩尔混合用于文库构建。在Illumina MiSeq或NovaSeq平台上使用双端测序（读长为2×250 bp或2×300 bp）进行测序。对于多样性分析，将所有样品稀释至每个样品10,000条高质量序列的深度，以确保α和β多样性指标的可比性。使用高质量序列在97%序列相似性阈值下聚类操作分类单元（OTUs）。具体而言，使用USEARCH或VSEARCH算法计算成对距离，通过UPGMA或层次聚类将相似度≥97%的序列分组到同一OTU。随后生成OTU表以总结所有样品中微生物类群的丰度分布。
统计分析使用Excel 2019处理数据，所有统计分析和图形可视化均使用R软件（版本4.1.0）进行。分解速率常数（k）使用单指数衰减模型计算：Xt= X0e-kt。质量剩余率（MR）计算为给定分解时间后残留凋落物质量与初始凋落物质量的比率：MR = (Xt/ X0) × 100%。凋落物中每种元素的释放或积累可以使用养分积累指数（R）来定量表征。R < 100%表示凋落物中养分的净释放，而R > 100%表示养分的净积累：R = (Mt× Ct) / (M0× C0) × 100%。
进行单因素方差分析（ANOVA）以评估不同处理对凋落物质量剩余、元素剩余、分解速率、优势微生物丰度和α多样性的影响，随后使用R中的“multcomp”包进行Tukey事后检验进行两两比较。采用线性混合效应模型（LMM）评估生境类型（H，植被区与非植被区）、埋藏深度（D，地表与15厘米深）、采样时间（T，第5、7、8、10、11和12个月）及其相互作用对凋落物质量损失、分解速率常数（k）、养分留存、优势微生物类群丰度和α多样性的影响。包含固定效应以量化这些因素对响应变量的个体和交互影响。具体而言，包含双向交互作用（生境类型×埋藏深度、生境类型×采样时间、埋藏深度×采样时间）和三向交互作用（生境类型×埋藏深度×采样时间）以检查潜在的协同或情境依赖性效应。为了考虑生境单元之间的固有变异性，将生境类型建模为随机截距。使用R中“lmerTest”包的lmer函数拟合模型，参数估计基于限制性最大似然法（REML）。模型选择以Akaike信息准则（AIC）和贝叶斯信息准则（BIC）为指导，优选具有最佳拟合度的最简约模型。进行全面的诊断检查以验证模型假设，包括残差正态性、方差齐性和随机效应分布的评估。对于统计显著的主效应或交互作用，使用Tukey诚实显著差异（HSD）检验进行事后两两比较，通过R中的emmeans包实现以控制家族误差率。此外，进行线性回归分析以评估凋落物性状与残留质量之间的关系。
为了探索微生物群落重叠，基于所有样品的OTU丰度数据，使用R中的VennDiagram包，将每个组视为一个独立的集合。计算OTU计数和集合间的共享成员。将OTU表在R中进一步处理，以评估处理间的微生物异质性，并构建门水平的相对丰度表。使用QIIME2在OTU表水平计算α多样性指标，包括Chao1、Observed_species、Shannon和Simpson指数。使用R中的ggplot2包进行α多样性和分类组成的可视化，以条形图和箱线图呈现。为了评估群落β多样性变异的模式及其驱动因素，计算Bray-Curtis相异矩阵以量化物种或功能群之间的组成差异，并使用非度量多维标度（NMDS）进行可视化。通过置换多元方差分析（PERMANOVA）评估组间差异的统计显著性。使用Spearman相关评估微生物α多样性、土壤理化性质和凋落物质量损失之间的关系。还计算Pearson相关系数以确定凋落物质量损失、凋落物特性和微生物群落变量之间的关联。最后，进行结构方程模型（SEM）以评估不同微生境通过凋落物特性和微生物丰度对凋落物质量损失和土壤养分循环的直接和间接影响。基于先验知识和文献，构建了一个假设模型，将凋落物特性和微生物丰度视为潜变量。
结果与分析
凋落物分解特征在整个分解期间，凋落物质量随时间持续下降。生境类型对凋落物质量剩余没有显著影响。然而，生境类型和埋藏深度之间的相互作用对凋落物质量动态有显著影响，并且这种交互作用的强度随时间增加。到12月时，非植被区的地表凋落物比植被区分解更快，植被区观察到更高的残留质量。相比之下，在15厘米埋藏深度，植被区的凋落物表现出更大的质量损失，残留质量低于非植被区。
残留养分对不同生境的响应在凋落物分解过程中，所有处理的C含量都表现出与质量损失相似的时间趋势。12个月后，平均剩余C含量分别为54.17±5.42%和40.76±4.12%。N残留显示出先增加后下降的趋势。生境对N残留有极显著影响。12个月后，非植被区的N残留分别显著高于植被区15.81%和16.56%。生境也显著影响凋落物C/N比。C/N比随时间在两种埋藏深度下均下降。12个月后，非植被区地表凋落物的C/N比比植被区低1.81个单位，而在15厘米深度趋势相反，但差异不显著。此外，C/N比与凋落物质量呈显著负相关，表明沙埋促进了C/N比降低，从而促进了质量损失。木质素含量在两种埋藏深度下均表现出持续的积累趋势。生境对木质素残留没有显著影响。然而，12个月后，非植被区地表凋落物的木质素残留显著比植被区少29.37%，但在15厘米埋藏深度这种差异不显著。木质素/N比在分解过程中先下降后增加。生境显著影响木质素/N比。12个月后，非植被区凋落物的木质素/N值分别显著低于植被区7.99和5.00个单位。除少数例外，木质素含量与凋落物质量剩余呈显著负相关。相反，木质素/N比与凋落物质量剩余呈显著正相关。这种模式可能反映了微生境变异引起的凋落物化学质量差异。
土壤微生物群落对不同生境的响应如花瓣图所示，在两种埋藏深度下，植被区的细菌和真菌OTU数量通常高于非植被区。我们分析了分解12个月后的微生物相对丰度和多样性，这一时期土壤微生物群落结构发生了显著变化。凋落物分解过程中土壤中的优势细菌门是厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。生境显著影响厚壁菌门和放线菌门的相对丰度，但对变形菌门没有显著影响。在表面和15厘米埋藏深度，植被区放线菌门的相对丰度分别显著高于非植被区18%和4%，而变形菌门和厚壁菌门显示出相反的趋势，尽管这些差异不显著。在15厘米沙埋处理下，植被区和非植被区放线菌门的相对丰度分别显著增加了25%和38%，而变形菌门分别显著增加了16%和15%。相比之下，厚壁菌门的相对丰度显著下降，在植被区和非植被区分别下降了45%和56%。对于土壤真菌，优势门是子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。在任一种埋藏深度处理下，生境之间子囊菌门和担子菌门的相对丰度没有观察到显著差异。此外，15厘米沙埋使植被区和非植被区担子菌门的相对丰度分别降低了2.21%和2.87%，而子囊菌门的相对丰度基本不变，且未受到显著影响。
线性混合模型分析显示，生境显著影响除变形菌门外的所有优势微生物类群，而沙埋处理对所有优势微生物均施加了显著影响。除厚壁菌门外，其余微生物类群在两种生境下均与凋落物C/N比呈显著负相关，并与木质素含量和木质素/N比呈显著正相关。在植被区，凋落物质量损失与放线菌门呈显著正相关，与厚壁菌门呈负相关。相比之下，在非植被区未观察到微生物类群与凋落物质量损失之间的显著关系。此外，子囊菌门与凋落物质量损失和木质素含量均呈显著正相关，但仅在植被区。值得注意的是，微生物α多样性指数与任何测量的理化参数均未显示显著相关性，表明微生物多样性本身的变异可能不足以影响该系统中的凋落物分解过程。
连接凋落物质量损失和土壤养分与凋落物特性、土壤微生物丰度和微环境条件的结构方程模型显示出良好的拟合度，分别解释了凋落物质量损失变异的86%和63%，以及土壤养分变异的55%和44%。微生境变化主要通过间接途径调节凋落物质量损失和土壤TC/TN，即通过改变C/N比、木质素含量以及凋落物中子囊菌门、放线菌门和变形菌门的相对丰度。植被覆盖对凋落物质量损失施加直接正向效应，对土壤TC/TN施加负向效应。它对凋落物C/N比产生负向影响，同时对木质素含量产生正向影响；反过来，较低的凋落物C/N比与凋落物质量损失负相关，而木质素对凋落物质量损失有正向影响。此外，植被覆盖提高了子囊菌门和放线菌门的相对丰度，两者均与凋落物质量损失呈正相关，其中子囊菌门显示出显著的正效应，放线菌门表现出相似但不显著的趋势。相比之下，裸露沙地对土壤微生物群落或凋落物质量损失没有显著影响，除了C/N比对质量损失的显著负效应。值得注意的是，裸露沙地对土壤TC/TN施加直接正向效应。总体而言，这些结果表明微生境变异对凋落物分解的影响主要是通过改变凋落物化学性质和土壤微生物群落的转变来介导的。
讨论
不同生境中的凋落物分解动态凋落物分解涉及养分含量的动态变化，养分释放或积累主要受凋落物化学成分和微生物养分需求之间相互作用的控制。在本研究中，C在所有处理下持续释放，遵循与质量损失相似的模式。这种现象可能归因于凋落物中C基化合物的高比例。与先前研究报告分解过程中N富集的研究相反，我们的研究结果显示在两种埋藏处理下均存在N的净释放。这种偏差可能由极端干旱条件下沙质土壤中有限的微生物活动解释，这限制了N的固定。此外，植被区的N残留显著低于非植被区，分别降低了15.81
