《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Distinct spatial distribution of potentiated dendritic spines in encoding- and recall-activated hippocampal neurons
编辑推荐：
本研究结合突触活性报告系统（SA-PSDΔVenus）与神经元激活标记技术（ESARE-dTurquoise），揭示了情境恐惧条件化（CFC）后小鼠海马CA1区锥体神经元在记忆编码与提取阶段，其树突棘增强（LTP相关）的空间分布差异。研究发现，编码阶段激活神经元在 stratum oriens 和 stratum lacunosum moleculare 层富集增强棘，而提取阶段激活神经元则在 stratum radiatum 层呈现更多增强棘。这一发现为理解记忆不同阶段突触可塑性的动态变化提供了单突触分辨率证据。
引言
神经科学领域的实验进展已经能够识别细胞记忆印迹（cellular engrams）——这些神经元集群的激活对记忆提取是必要且充分的。突触可塑性，包括长时程增强（long-term potentiation, LTP），是记忆编码和提取的基础，但学习诱导的树突棘增强与神经元整体激活之间的关系仍不明确。
材料与方法
研究采用了一种与增强一致的翻译依赖性突触后报告蛋白（SA-PSDΔVenus）和一个神经元激活报告蛋白（ESARE-dTurquoise），以确定它们在小鼠情境恐惧条件化（contextual fear conditioning, CFC）后海马CA1区的时空相关性。通过子宫内电穿孔技术将相关构建体导入小鼠海马CA1区。实验动物分为不同组别：居家笼对照组（HC）、CFC组（训练后90分钟或24小时灌注）、以及24小时后重暴露于条件化环境（AA组）或不同环境（AB组）的组别。使用共聚焦显微镜成像，并通过ImageJ进行图像分析，统计检验包括双向方差分析（ANOVA）等。
结果
SA-PSDΔVenus在原代海马神经元增强的树突棘处表达
为了定位增强的树突棘，研究人员使用了受Arc基因5'和3'非翻译区（UTR）翻译控制的PSDΔ95–mVenus–HA融合报告蛋白（SA-PSDΔVenus）。该构建体在原代海马神经元培养中，经过增强诱导刺激后，在树突棘处显示出报告蛋白表达增加。与先前报道的构建体相比，PSDΔVenus即使在神经元培养中也显示出极少的胞体和树突干表达，表明其棘特异性更高，能够明确检测增强的棘。
通过10 mM KCl进行轻度去极化诱导突触增强，显著增加了SA-PSDΔVenus阳性树突棘的比例。相反，用NMDA受体（NMDAR）拮抗剂AP5阻断突触增强则降低了SA-PSDΔVenus阳性树突棘的比例。作为对照，缺乏Arc UTR的构建体（PSDΔVenus）则在几乎所有树突棘中表达，与处理无关。
甘氨酸诱导的突触增强（Gly-cLTP）增加了SA-PSDΔVenus阳性棘的棘体积和GluA1水平。SA-PSDΔVenus阳性棘的比例与具有 elevated GluA1水平的树突棘比例相当。并且，显著更大比例的SA-PSDΔVenus阳性棘表现出elevated GluA1水平。这些数据表明，SA-PSDΔVenus以活动和NMDAR依赖的方式选择性标记与增强一致的树突棘。
情境恐惧条件化增加海马CA1神经元中的SA-PSDΔVenus阳性棘
为了检查体内记忆形成过程中增强的树突棘的分布，研究人员通过三电极子宫内电穿孔技术在小鼠海马CA1区表达SA-PSDΔVenus，并对其进行CFC训练。使用Tet-ON系统实现SA-PSDΔVenus表达的时间控制。
在mCherry阳性的海马CA1锥体神经元的树突棘中观察到了SA-PSDΔVenus表达。为了评估情境恐惧条件化的层特异性效应，研究人员量化了树突片段上SA-PSDΔVenus阳性棘的比例，这些片段分布在 stratum oriens (SO)、近端和远端 stratum radiatum (pSR 和 dSR) 以及 stratum lacunosum moleculare (SLM)。
与居家笼对照组（HC）小鼠相比，CFC小鼠在所有CA1层中均表现出SA-PSDΔVenus阳性棘比例显著增加。这种增加在CFC后90分钟在SO和SLM层就很明显。相比之下，在pSR和dSR层的增加在90分钟时较不明显，但在24小时后变得显著。在HC小鼠中，SA-PSDΔVenus阳性棘的比例在90分钟和24小时时相似，表明CFC小鼠SR层中观察到的延迟增加并非由于多西环素可用时间延长所致。
为了确定环境重暴露是否会进一步诱导SA-PSDΔVenus表达，动物在恐惧条件化24小时后被重新暴露于条件化环境A（AA组）或不同环境（AB组）。在所有CA1层中，CFC24组、AA组和AB组之间的SA-PSDΔVenus阳性棘比例相当。这与多西环素快速清除一致，表明SA-PSDΔVenus标记的是学习过程中增强的棘，而非AA和AB小鼠回忆过程中的增强。
ESARE-dTurquoise阳性激活神经元在恐惧条件化后含有更高比例的SA-PSDΔVenus阳性增强棘
为了识别激活的神经元，研究人员共电穿孔了第三个构建体（ESARE-dTurquoise），该构建体在增强型突触活动响应元件（ESARE）启动子控制下表达一个包含N端FLAG标签、mTurquoise2和C端去稳定化标签的融合蛋白。ESARE是活性依赖性Arc启动子的工程化版本，C端去稳定化标签缩短了蛋白质半衰期，使报告蛋白表达与内源性即刻早期基因（IEG）动态保持一致。与该设计一致，ESARE-dTurquoise与内源性IEG c-fos显示出强烈的重叠。超过80%的c-fos阳性海马CA1神经元表达ESARE-dTurquoise，表明它可靠地报告了神经元激活。
接下来，研究人员分析了在CFC后90分钟处于激活（mCherry+/ESARE-dTurquoise+）或非激活（mCherry+/ESARE-dTurquoise-）状态的海马CA1神经元中SA-PSDΔVenus阳性棘的分布。在SO和SLM层，观察到ESARE-dTurquoise阳性神经元中SA-PSDΔVenus阳性棘的比例高于ESARE-dTurquoise阴性神经元，表明神经元激活与突触增强之间存在相关性。在HC小鼠中，激活和非激活神经元之间的SA-PSDΔVenus阳性棘比例相当，且ESARE-dTurquoise阳性神经元的数量很少。
研究人员随后在CFC后24小时将一组CFC小鼠重新暴露于条件化环境A（AA组）。在这种条件下，ESARE-dTurquoise报告由环境重暴露诱导的神经元激活，而SA-PSDΔVenus标记的是CFC过程中增强的树突棘。环境重暴露不会诱导SA-PSDΔVenus表达，这与多西环素在给药后24小时内从脑中清除一致。在pSR和dSR层，ESARE-dTurquoise阳性神经元中SA-PSDΔVenus阳性棘的比例高于ESARE-dTurquoise阴性神经元。相比之下，暴露于不同环境B的CFC小鼠（AB组）则显示出相反的模式。在AB组中，pSR和dSR层ESARE-dTorquoise阳性神经元中SA-PSDΔVenus阳性棘的比例低于ESARE-dTorquoise阴性神经元。
总之，神经元激活与突触增强在CFC和AA小鼠中呈正相关，而在AB小鼠中呈负相关。在CFC小鼠中，这种相关性在SO和SLM层最强，而在AA小鼠中，则在pSR和dSR层最为明显。
讨论
神经科学的实验进展使得识别细胞记忆印迹成为可能，但大多数印迹标记策略依赖于标记整个神经元的IEG报告蛋白，对于学习过程中这些神经元内哪些特定突触被修饰提供了有限的见解。因此，细胞记忆印迹与突触特异性可塑性之间的关系仍未完全阐明。本研究结合了用于神经元激活的活性依赖性报告蛋白（ESARE-dTorquoise）和用于翻译依赖性突触增强的报告蛋白（SA-PSDΔVenus），直接研究了学习诱导的突触可塑性在CFC过程中如何在激活和非激活神经元之间分布。
在原代海马神经元中，SA-PSDΔVenus选择性标记了与NMDAR依赖性突触增强一致的树突棘。标记的棘表现出体积增加和GluA1水平升高，这与长时程增强（LTP）已确立的结构和分子相关性一致。
将这种方法扩展到体内，研究发现CFC诱导海马CA1神经元中SA-PSDΔVenus阳性棘显著增加，与居家笼对照组相比。这种增加表现出层和时间依赖性动态，在 stratum oriens (SO) 和 stratum lacunosum moleculare (SLM) 快速增强，而在 stratum radiatum (SR) 延迟增加。这些观察结果与先前的证据一致，即记忆巩固涉及学习后睡眠和安静清醒期间CA1环路的再激活，特别是沿着CA3–CA1通路。因此，研究人员推测SR中的延迟突触增强反映了巩固相关的可塑性。
通过联合标记激活的神经元（ESARE-dTorquoise+）和增强的突触，研究证明在学习过程中激活的神经元比非激活神经元含有更高比例的SA-PSDΔVenus阳性棘。这一发现直接将学习诱导的神经元激活与个体神经元内突触可塑性的空间分布联系起来。
使用IEG标记、电生理学和钙成像已广泛记录到学习激活神经元在回忆过程中的再激活，尽管编码和回忆集群之间的重叠通常不完全。本研究结果表明，这种再激活偏向于含有更高比例学习诱导增强棘的神经元，特别是在SR内。这一解释与研究表明破坏学习激活神经元中的突触可塑性会损害神经元再激活和记忆回忆的结果一致。
需要区分突触活性报告蛋白与标记翻译依赖性长时程增强（LTP）的报告蛋白，后者目前是SynActive系列方法独有的特点。尽管存在这种区别，多项研究利用互补策略将学习过程中的突触活性与神经元招募联系起来，包括AMPAR脉冲追踪标记、双eGRASP和光转化突触报告蛋白等。与这些发现一致，本研究在CFC小鼠中观察到神经元激活与增强突触定位之间存在正相关。最近的研究表明，除了神经元集群重叠之外，分支特异性树突可塑性对于记忆链接也至关重要。将SynActive整合到此类方法中，可以进一步提高记忆分配的分辨率，从神经元和树突分支到单个棘，或有助于识别"树突记忆印迹"。
尽管SynActive策略具有潜力，但需要承认几个局限性。首先，研究未评估SA-PSDΔVenus标记的持久性或更替，对于标记的棘是长期维持还是被新的增强事件所取代的问题尚未解决。其次，尽管去稳定化报告蛋白旨在反映瞬时激活，但其在远端树突中的精确降解动力学和扩散特性需要进一步表征。第三，ESARE-dTorquoise表达可能受到环境暴露相关的新奇性或应激的影响，可能独立于学习或回忆而促成神经元激活。第四，增强棘的数量或空间分布如何与记忆强度（例如僵直行为）相关联仍有待确定。
总之，这项研究提供了突触分辨率的证据，将联想记忆不同阶段的神经元激活与个体神经元内学习诱导增强棘的定位联系起来。这些发现可能为树突整合和突触可塑性的计算模型提供信息，并扩展到生理和病理背景下记忆机制的研究。
