《Frontiers in Oncology》：Identification of endogenous reference genes for RT-qPCR analysis in breast cancer and matched adjacent tissues
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本研究通过RT-qPCR技术系统评估β-actin、18S rRNA、PUM1、RPLP0和TFRC五种内参基因在乳腺癌及癌旁组织中的表达稳定性。结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法及RefFinder整合分析，发现TFRC和18S rRNA在癌组织中稳定性最佳，而癌旁组织内参基因均不稳定。研究强调内参基因选择需结合组织类型及临床病理参数，为乳腺癌基因表达精准定量提供关键方法学支持。
背景
乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，年死亡人数达67万。在中国，乳腺癌发病率自20世纪90年代以来快速上升，且年轻化趋势显著。基因表达研究对乳腺癌早期诊断、治疗及预后评估至关重要，而实时定量PCR（RT-qPCR）的准确性高度依赖于稳定的内参基因（RGs）。本研究旨在筛选乳腺癌及癌旁组织中表达稳定的内参基因。
材料与方法
研究纳入30例乳腺癌患者的癌组织及匹配癌旁组织（距肿瘤边缘≥2.0 cm），通过RT-qPCR分析β-actin、18S rRNA、PUM1、RPLP0和TFRC五种候选内参基因的表达。采用描述性统计、GeNorm（M值<1.5为稳定）、NormFinder（稳定性值SV越低越稳定）、BestKeeper（标准差SD<1为稳定）和ΔCt法评估基因稳定性，并通过RefFinder计算几何平均数（GM）进行综合排名。
结果
在癌组织中，18S rRNA的Ct值范围最窄（3.96），描述性统计显示其稳定性良好（平均Ct=8.43，SD=0.84）。RefFinder排名中TFRC稳定性最高（GM=1.19），其次为18S rRNA（GM=1.41）。GeNorm和BestKeeper仅验证18S rRNA符合稳定性阈值（M=0.912，SD=0.84）。在癌旁组织中，TFRC的Ct值范围最小（6.29）且RefFinder排名最优（GM=1.00），但GeNorm（M=2.364）和BestKeeper（SD=4.30）均提示其不稳定。所有候选基因在癌旁组织中的Ct值均显著高于癌组织（p<0.001）。亚组分析显示，癌旁组织中β-actin在年轻患者（<50岁）表达更高，18S rRNA和PUM1在Ki67≤30%组表达较低。
讨论
TFRC和18S rRNA是乳腺癌组织中最具潜力的内参基因，但癌旁组织及联合分析中无稳定内参基因。内参基因稳定性受组织类型、样本处理及疾病阶段影响，如18S rRNA在MCF-7细胞中稳定，却在甲状腺癌中稳定性差。本研究首次将临床病理参数纳入内参基因筛选体系，提升结果的临床适用性。未来需通过大样本、多组学联合验证优化内参基因选择策略。
结论
TFRC和18S rRNA适用于乳腺癌组织的RT-qPCR标准化，而癌旁组织需进一步探索更稳定的内参基因。
