星形胶质细胞通过NLRP3炎症小体-GSDMD-IL-1β轴自主限制SARS-CoV-2感染的新机制

《Frontiers in Immunology》：NLRP3 inflammasome activation in astrocytes restricts SARS-CoV-2 through gasdermin-D-driven IL-1β release

本文揭示了星形胶质细胞通过NLRP3炎症小体-GSDMD-IL-1β轴自主限制SARS-CoV-2感染的关键机制。研究发现病毒核衣壳（N）和刺突（S）蛋白通过K+外流、活性氧（ROS）和组织蛋白酶B途径激活NLRP3炎症小体，进而通过Gasdermin-D（GSDMD）介导的IL-1β释放（而非细胞焦亡）有效控制病毒复制。这一发现为理解中枢神经系统（CNS）抗病毒免疫提供了新视角。

　　

1 引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是近二十年来出现的第三种高致病性人类冠状病毒。尽管主要是一种呼吸道病毒，但SARS-CoV-2能够侵入中枢神经系统（CNS），导致中风、脑病和记忆力丧失等严重神经系统表现。然而，神经细胞控制SARS-CoV-2感染的机制尚不清楚。人类星形胶质细胞已被确定为大脑中SARS-CoV-2复制的关键场所。研究使用皮质类器官和死后脑组织表明，即使在没有显著ACE2表达的情况下，星形胶质细胞也高度易感于感染和病毒复制，这表明存在替代的病毒进入途径。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的胶质细胞，在维持大脑稳态方面发挥着基础性作用。它们为神经元提供代谢支持，调节神经递质回收，并维持血脑屏障的完整性。此外，星形胶质细胞表达多种模式识别受体（PRRs），使其能够感知和应对感染。然而，其自主抗病毒反应的机制，特别是在SARS-CoV-2背景下，仍然知之甚少。在PRRs中，炎症小体已成为对SARS-CoV-2先天免疫反应的核心组成部分。该病毒可以感染单核细胞并激活NLRP3和AIM2等炎症小体。这些平台的过度激活会导致细胞焦亡，并在炎症小体相关基因（如GSDMD、NLRP3、NLRC4）表达升高的个体中导致疾病严重程度增加。然而，炎症小体在控制SARS-CoV-2传播中的作用，尤其是在中枢神经系统中，仍未得到探索。死后研究在神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞中检测到SARS-CoV-2核衣壳蛋白，以及ACE2表达和NLRP3炎症小体组分，实验数据表明病毒刺突蛋白可以通过ACE2和NF-κB信号通路在小胶质细胞中激活NLRP3。然而，星形胶质细胞内在的炎症小体激活是否有助于SARS-CoV-2感染期间的抗病毒防御，在很大程度上仍未探索。这一空白至关重要，因为星形胶质细胞不仅是病毒的主要复制场所，而且影响中枢神经系统的免疫微环境。

2 材料与方法

本研究提交并获得了圣保罗联邦大学（UNIFESP）动物使用伦理委员会的接受，注册号为1368130918。C57BL/6（野生型）、Nlrp3^-/-、Nlrc4^-/-、Caspase-1/11^-/-小鼠和Gsdmd^-/-小鼠在无特定病原体（SPF）条件下于微隔离器中维持，自由获取水和食物。原代星形胶质细胞来自出生后0-3天（P0-P3）的小鼠。混合胶质细胞培养维持14天以允许细胞扩增。通过轨道摇动分离星形胶质细胞和小胶质细胞。所有使用SARS-CoV-2的实验均在生物安全三级（BSL3）实验室进行。使用SARS-CoV-2 Gamma毒株（P.1），通过组织培养感染剂量（TCID₅₀）法进行滴定。使用Vero E6细胞进行TCID₅₀测定，通过Reed–Muench方法计算滴度。细胞用LPS（200 ng/mL）处理3小时以诱导炎症小体组分的转录启动。尼日利亚菌素（10 nM/mL，1小时）直接加入培养物。使用药理学抑制剂（CA-074Me、KCl、Apocynin）抑制组织蛋白酶、K⁺外流和ROS。使用Lipofectamine 3000将重组SARS-CoV-2核衣壳（N）或刺突（S）蛋白递送至细胞内。小鼠星形胶质细胞以3 × 10⁵细胞/孔（用于定量实时PCR）或3 × 10⁴细胞/孔（用于免疫荧光）的浓度铺板，然后用SARS-CoV-2以0.1和1的感染复数（MOI）感染2小时。通过RT-qPCR测定病毒载量，使用针对病毒Rdrp的引物和探针。通过ELISA测量细胞因子IL-1β和成熟caspase-1。通过免疫荧光检测GFAP、ASC和刺突蛋白。通过乳酸脱氢酶（LDH）活性测定评估细胞裂解。使用GraphPad Prism 9.3.0进行统计分析，应用双向ANOVA或单向ANOVA，然后进行适当的事后检验。

3 结果

3.1 SARS-CoV-2感染并诱导星形胶质细胞中的炎症小体激活

首先，研究人员调查了SARS-CoV-2是否能够感染并激活星形胶质细胞中的炎症小体。为此，从新生小鼠（E0-E3）获得的原代皮质星形胶质细胞用LPS预处理以诱导炎症小体组分（如NLRP3和pro-IL-1β）的转录启动，这是完全激活典型炎症小体通路所需的步骤。随后，星形胶质细胞在体外用SARS-CoV-2 Gamma毒株以0.1和1的感染复数（MOI）感染。SARS-CoV-2以MOI依赖性方式感染并在星形胶质细胞中复制，在MOI为1感染的细胞裂解物和上清液中获得更高的病毒载量。病毒复制在感染后48小时达到峰值，特别是在细胞裂解物中，并从72小时逐渐下降，最终从上清液中完全清除，表明星形胶质细胞能够随时间控制感染。虽然两种MOI（0.1和1）都能实现病毒感染复制，但只有MOI为1诱导了典型的炎症小体激活标志物，如ASC斑点形成、IL-1β释放和乳酸脱氢酶（LDH）释放（用作裂解性细胞死亡的标志物）。这些激活信号在感染后72小时更为突出。重要的是，SARS-CoV-2也在未用LPS预处理的星形胶质细胞中复制并诱导ASC斑点形成、caspase-1激活和IL-1β释放，表明SARS-CoV-2能够在启动和未启动的星形胶质细胞中触发炎症小体激活，尽管可能幅度不同。

3.2 SARS-CoV-2诱导星形胶质细胞中的NLRP3炎症小体激活

鉴于SARS-CoV-2对NLRP3炎症小体的激活在人和小鼠单核细胞中已被广泛记录，研究人员调查了星形胶质细胞中是否发生类似机制。为此，来自NLRP3缺陷（Nlrp3^-/-）和caspase-1/11缺陷（Casp1/11^-/-）小鼠的星形胶质细胞用SARS-CoV-2（MOI为1）感染。在这两种敲除模型中，与野生型对照相比，ASC斑点形成、caspase-1激活和IL-1β分泌均显著减少。重要的是，在未用LPS预处理的星形胶质细胞中也观察到类似的减少，进一步支持了SARS-CoV-2在启动和未启动条件下均激活星形胶质细胞中NLRP3炎症小体通路的结论。

3.3 SARS-CoV-2 N和S蛋白通过常见胞质途径激活NLRP3

为了研究SARS-CoV-2诱导星形胶质细胞中NLRP3激活的机制，研究人员在LPS启动后用重组核衣壳（N）和刺突（S）病毒蛋白刺激这些细胞。两种蛋白均诱导了ASC斑点形成和星形胶质细胞的IL-1β分泌，而与鞭毛蛋白（一种NLRC4激动剂）或不相关的对照蛋白形成对比。值得注意的是，在缺乏NLRP3或caspase-1的情况下，星形胶质细胞对N和S蛋白的反应显著降低，表明SARS-CoV-2通过其结构蛋白N和S触发NLRP3激活。由于NLRP3在免疫细胞中的激活通常由PAMPs或DAMPs诱导的胞质扰动触发，例如K⁺外流、组织蛋白酶释放和线粒体ROS生成，研究人员调查了这些信号是否是星形胶质细胞中SARS-CoV-2激活NLRP3所必需的，类似于经典激动剂尼日利亚菌素。研究人员观察到，这些通路的抑制消除了对N和S蛋白的IL-1β产生，证实SARS-CoV-2通过由其病毒蛋白触发的经典信号通路激活星形胶质细胞中的NLRP3。

3.4 NLRP3炎症小体限制星形胶质细胞中的SARS-CoV-2复制

为了评估NLRP3炎症小体在控制SARS-CoV-2中的作用，研究人员量化了缺乏该炎症小体组分的星形胶质细胞中的病毒载量。在感染后72小时，在Nlrp3^-/-和casp-1/11^-/-星形胶质细胞中观察到显著更高的病毒载量，但在Nlrc4^-/-细胞中未观察到，无论是在细胞裂解物还是上清液中，这与细胞内的病毒染色一致。此外，在没有LPS启动的情况下也观察到类似的结果。而且，通过TCID₅₀测定确定的感染性病毒颗粒的释放在缺乏NLRP3的情况下显著增加，进一步证实了其在抗病毒防御中的作用。总之，这些结果表明NLRP3炎症小体在限制星形胶质细胞中SARS-CoV-2复制方面起着至关重要的作用。

3.5 Gasdermin-D依赖的IL-1β释放参与星形胶质细胞对SARS-CoV-2的控制

在确定了NLRP3炎症小体在控制SARS-CoV-2复制中的作用后，研究人员接下来研究了所涉及的下游效应机制。炎症小体激活通常通过GSDMD孔形成触发细胞焦亡和细胞因子释放。为了评估GSDMD的贡献，研究人员感染了来自Gsdmd缺陷小鼠的星形胶质细胞。与野生型（WT）对照相比，Gsdmd^-/-星形胶质细胞在细胞裂解物和上清液中均表现出显著更高的病毒载量。然而，在WT和Gsdmd^-/-星形胶质细胞之间未检测到LDH释放的差异，表明GSDMD介导的细胞焦亡不是感染控制的主要机制。相反，Gsdmd^-/-培养物中的IL-1β水平显著降低，表明GSDMD通过IL-1β释放调节病毒控制。支持这一点的是，外源性IL-1β的添加导致病毒载量呈剂量依赖性降低。重要的是，病毒控制与各培养物中的IL-1β水平密切相关，并且外源性IL-1β不影响星形胶质细胞活力（通过LDH释放评估）。此外，重组IL-1β处理在Nlrp3^-/-、Casp1/11^-/-和Gsdmd^-/-星形胶质细胞中恢复了抗病毒活性，表现为细胞内病毒染色减少和病毒RNA减少。这些数据表明，GSDMD下游的IL-1β释放是限制星形胶质细胞中SARS-CoV-2的关键效应机制。重要的是，即使没有LPS，缺乏GSDMD仍然导致病毒载量增加，而IL-1β补充足以恢复抗病毒反应。总之，这些发现强调星形胶质细胞拥有一种内在的、炎症小体依赖的机制，通过GSDMD介导的IL-1β释放来限制SARS-CoV-2复制，而不依赖于外源性启动信号。

4 讨论

炎症小体在控制由先天免疫细胞介导的感染中起着至关重要的作用。最近的研究揭示了它们在非免疫细胞中激活效应机制的能力，包括肠上皮细胞（IECs）、内皮细胞、肾上皮细胞、角质形成细胞、破骨细胞和中枢神经系统（CNS）细胞。在星形胶质细胞中，炎症小体激活可能产生有益或有害的后果，具体取决于背景。然而，炎症小体在星形胶质细胞自主控制感染能力中的作用研究甚少。本研究团队最近的一份报告证明caspase-1/11在星形胶质细胞控制ZIKV感染的能力中扮演非传统角色。即使在没有典型的炎症小体激活信号（例如ASC斑点、IL-1β、细胞焦亡）的情况下，ZIKV对caspase-1的激活似乎抑制了糖酵解途径，从而阻止了ZIKV在星形胶质细胞内的复制。本文证明SARS-CoV-2触发小鼠星形胶质细胞中的典型NLRP3炎症小体激活，导致GSDMD依赖的IL-1β分泌，这在控制病毒复制中起关键作用。值得注意的是，研究表明即使在没有LPS启动的情况下，炎症小体激活的标志性特征（例如ASC斑点、IL-1β和caspase-1切割）也会响应SARS-CoV-2感染而发生，表明星形胶质细胞拥有内在的病原体感应机制，能够在病毒挑战时启动炎症小体组装。在未启动条件下，在Nlrp3^-/-和caspase-1/11^-/-星形胶质细胞中观察到的加剧的病毒复制进一步强调了该通路的功能相关性。总之，这些发现强调了星形胶质细胞炎症小体信号作为针对神经嗜性病毒感染的重要早期防御机制的生理重要性。虽然许多研究集中在SARS-CoV-2对呼吸系统的影响，但其对中枢神经系统的影响由于感染个体中观察到的多种神经系统症状而引起了显著关注。这些包括认知障碍、脑病和中风，表明SARS-CoV-2可能影响中枢神经系统内的神经炎症过程。然而，神经炎症是由病毒的存在、炎症介质穿过血脑屏障的泄漏，还是两者共同作用的结果，仍有待阐明。事实上，值得关注的SARS-CoV-2变异株（VOCs），如武汉、Beta和Delta变异株，似乎感染神经细胞，包括星形胶质细胞。尽管Gamma变异株的神经嗜性尚未得到证实，但其与其前身 phylogenetic 上的接近性以及共享突变（如D614G）的存在支持了我们的发现，即SARS-CoV-2 Gamma感染并在星形胶质细胞中复制。这通过病毒载量测量和这些细胞内病毒蛋白的检测得到证实，表明星形胶质细胞支持完整的病毒生命周期并释放感染性病毒颗粒，如TCID₅₀测定中所观察到的。然而，仅在MOI为1时观察到炎症小体的激活，因此表明低病毒载量不足以诱导这些平台的组装。重要的是，炎症小体激活是快速病毒清除所必需的，因为来自WT小鼠的星形胶质细胞可以在感染后72小时内清除病毒。这些发现与先前强调NLRP3炎症小体在病毒（包括SARS-CoV-2）免疫反应中关键作用的研究一致。富含GU的基因组RNA、ORF3a病毒孔蛋白和N蛋白已被确定为THP1和A549细胞系中NLRP3炎症小体的激活剂。有趣的是，虽然N蛋白诱导炎症小体激活，但据报道它也抑制GSDMD，从而阻断细胞焦亡和IL-1β的释放。相反，S蛋白在COVID-19患者的巨噬细胞中上调NLRP3表达并诱导IL-1β释放。在星形胶质细胞中，SARS-CoV-2的N和S蛋白通过涉及K⁺外流、ROS生成和溶酶体组织蛋白酶释放的途径激活NLRP3，如对单核细胞所述。此外，我们的研究强调了下游炎症小体机制在控制病毒感染中的重要性。虽然GSDMD被认为是细胞焦亡的关键效应器，但Gsdmd缺陷的星形胶质细胞表现出增加的SARS-CoV-2复制，而没有相应的细胞死亡增加。这表明细胞焦亡不是炎症小体在星形胶质细胞中限制SARS-CoV-2复制的主要机制，这与在单核细胞中的发现形成对比。相反，GSDMD似乎在IL-1β释放中起关键作用，强调了细胞因子介导的抗病毒防御优于细胞死亡机制的重要性。相应地，重组IL-1β处理显著降低了野生型和炎症小体缺陷星形胶质细胞中的病毒载量和感染性颗粒。有趣的是，虽然IL-1β有效抑制了病毒复制，但它并未诱导细胞死亡，表明IL-1β在不损害星形胶质细胞活力的情况下限制病毒复制。尽管IL-1β在星形胶质细胞中抑制SARS-CoV-2复制的确切机制仍有待阐明，但已知星形胶质细胞分泌的IL-1β可以通过旁分泌和自分泌信号发挥作用，可能影响附近的细胞，如神经元和小胶质细胞。总之，我们的研究结果揭示，SARS-CoV-2可以在启动和未启动条件下触发星形胶质细胞中的炎症小体激活。虽然LPS启动仍然是放大和剖析炎症小体相关反应的宝贵实验工具，但未启动条件下的激活可能更生理相关地代表了病毒感染期间中枢神经系统内运作的先天免疫机制。作为中枢神经系统中最丰富的细胞类型和SARS-CoV-2复制的关键场所，星形胶质细胞在病毒控制中起着至关重要的作用。因此，理解炎症小体在其自主限制病毒复制能力中的参与具有根本重要性。虽然必须仔细管理神经炎症的潜在有害影响，但靶向炎症小体为限制SARS-CoV-2在脑细胞中的传播提供了一种有前景的策略。