宫颈癌淋巴结转移与多器官微生物组特征关联研究及口腔菌群预测模型构建

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：A potential association between the characteristics of the multi-organ microbiota and lymph node metastasis in cervical cancer

本研究首次揭示宫颈癌（CC）淋巴结转移（LNM）患者存在多部位（肠道、尿液）微生物组结构紊乱及尿液微生物α-多样性降低（PSob= 0.0272, PShannon= 0.0209）。基于口腔特异性菌群（葡萄球菌属、Erysipelotrichaceae UCG-003、霍氏真杆菌群）构建的LNM预测模型曲线下面积（AUC）达0.798，为CC淋巴结状态评估提供了非侵入性新方法。

　　

引言

宫颈癌（Cervical Cancer, CC）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位居女性癌症第四位，且呈现发病年轻化的趋势，对女性健康和经济构成重大威胁。淋巴结转移（Lymph Node Metastasis, LNM）是宫颈癌的主要转移途径，也是其分期和预后的关键因素，直接影响治疗方案的选择和患者生存率。2018年国际妇产科联盟（FIGO）分期系统已将LNM纳入宫颈癌分期标准。

人体内微生物群携带的遗传物质被称为人类微生物组，其在恶性肿瘤的发生、进展、转移及耐药性中扮演着关键角色。近年研究表明，微生物组能够调节恶性肿瘤的LNM。例如，中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）可通过分泌蛋白及直接细胞接触增强结直肠癌（CRC）细胞的迁移和侵袭能力，并与淋巴结和远处转移相关。在伴有LNM的肺鳞状细胞癌患者的肿瘤驻留微生物组中，变形菌属（Proteus）和拟杆菌属（Bacteroides）的存在与可能促进LNM的基因集有关。尽管关于微生物组促进肿瘤LNM的研究日益增多，但微生物组对宫颈癌患者LNM的影响尚不明确。

本研究旨在通过收集宫颈癌患者的口腔、粪便、尿液和阴道分泌物样本，分析伴有和不伴有LNM的宫颈癌患者多部位菌群结构差异，筛选与LNM相关的多部位菌群，并建立宫颈癌LNM的预测模型，为临床LNM评估提供新的预测靶点和简便的诊断方法。

材料与方法

研究参与者与伦理声明

研究人群为2021年12月至2022年7月期间入住昆明医科大学第三附属医院的宫颈癌患者。纳入标准包括：鳞状细胞癌或腺癌；年龄18-75岁；无其他肿瘤；未接受过抗肿瘤治疗；生物样本采集前一个月内未服用抗生素、益生菌或其他药物。排除标准包括：宫颈肉瘤、神经内分泌癌等病理诊断；采样前1周内有阴道灌洗或48小时内有性生活。

LNM的诊断基于病理学或影像学证据。计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）的LNM标准包括淋巴结短轴直径≥10mm和/或存在特定形态特征。

微生物组样本收集与测序

阴道分泌物样本在妇科检查时从阴道后穹窿收集。患者自行收集晨起清洁中段尿和粪便样本。口腔样本由患者使用无菌一次性棉签反复擦拭脸颊和舌侧自行收集。所有样本在采集后1小时内于液氮中快速冷冻，并转移至-80°C冰箱保存。

使用HiPure Stool DNA Kits提取微生物DNA。以稀释的基因组DNA为模板，使用带条形码的特异性引物（341F, 806R）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增细菌16S rDNA V3-V4区。PCR产物纯化后，在Illumina Novaseq 6000测序平台上进行PE250模式测序。

序列数据处理

使用FASTP对原始读数进行质控过滤获得高质量清洁读数。使用FLASH合并双端清洁读数生成原始标签。过滤噪声序列后，使用UPARSE算法将清洁标签按≥97%相似度聚类为操作分类单元（OTUs），并使用UCHIME算法去除嵌合体，最终获得有效标签进行分析。基于SILVA数据库，使用RDP分类器对代表性OTU序列进行分类学注释。

统计分析

使用Krona可视化物种分类丰度。使用QIIME分析α-多样性指数（Sob指数、Pielou指数、Shannon指数、Simpson指数），并使用Wilcoxon检验比较组间差异。基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析（PCoA），并结合Adonis检验评估组间β-多样性差异。使用指示值分析和线性判别分析效应大小（LEfSe）筛选各组生物标志物。基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库，使用PICRUSt2进行功能通路预测分析。

使用IMB SPSS 29.0进行统计学分析。通过二元逻辑回归分析建立宫颈癌患者LNM的预测模型。绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估潜在生物标志物的性能。P < 0.05认为有统计学意义。

结果

临床特征

本研究共纳入72例宫颈癌患者，其中34例无LNM，38例有LNM。两组间仅在肿瘤最大直径上观察到统计学显著差异（P < 0.001）。

微生物组成与淋巴结状态相关

宫颈癌患者的主要口腔菌群为链球菌属（Streptococcus）。在LNM组患者的肠道微生物组中，拟杆菌属（Bacteroides）和粪杆菌属（Fecalibacterium）的相对丰度相较于非LNM组降低。在尿道微生物组中，LNM组肠球菌属（Enterococcus）的相对丰度增加，而加德纳菌属（Gardnerella）、乳杆菌属（Lactobacillus）和厌氧球菌属（Anaerococcus）的相对丰度显著低于非LNM组。在阴道菌群中，LNM组加德纳菌属（Gardnerella）和消化链球菌属（Peptoniphilus）的相对丰度显著低于非LNM组。

伴有和不伴有LNM的宫颈癌患者的微生物多样性

两组患者的口腔微生物α-多样性（P_Sob= 0.9012, P_Shannon= 0.5189）和β-多样性（R2 = 0.015, P = 0.39）无显著差异。两组患者的粪便微生物α-多样性（P_Sob= 0.6397, P_Shannon= 0.5635）无显著差异，但β-多样性存在显著差异（R2 = 0.0266, P = 0.033）。与非LNM组相比，LNM组宫颈癌患者的尿液微生物物种丰富度和均匀度均降低（P_Sob= 0.0272, P_Shannon= 0.0209），且微生物组成存在显著差异（R2 = 0.0379, P = 0.002）。两组患者的阴道微生物α-多样性（P_Sob= 0.8832, P_Shannon= 0.8018）和β-多样性（R2 = 0.0217, P = 0.098）均无显著差异。

宫颈癌患者LNM相关微生物生物标志物的筛选及临床预测模型的建立

指示物分析结果显示，孪生球菌属（Atopobium）、不动杆菌属（Acinetobacter）等被确定为LNM组的口腔微生物生物标志物。在LNM组的肠道和尿液菌群中也分别鉴定出多个指示菌属。LEfSe分析在属水平上显示，LNM组口腔菌群的生物标志物为弧菌属（Vibrio）。四种肠道菌群（不动杆菌属、毛螺菌属（Lachnoclostridium）等）被确定为LNM组肠道微生物组的生物标志物。在尿液微生物组中，仅肠球菌属在LNM组中富集。在LNM组的阴道微生物组中未发现具有统计学意义的标志性菌群。

通过整合LEfSe分析和指示物分析确定的多部位标志菌属建立预测模型。口腔微生物组中葡萄球菌属（Staphylococcus）、Erysipelotrichaceae UCG-003 sp.和霍氏真杆菌群（Eubacterium hallii group）的相对丰度被确定为宫颈癌患者发生LNM的独立影响因素（P < 0.05）。建立的预测模型为：logit (P) = -1.344 + 52.081 × Staphylococcus + 320.699 × Erysipelotrichaceae UCG-003 sp. - 237.932 × Eubacterium hallii group。该模型预测宫颈癌患者LNM的准确度较高（AUC = 79.8%），约登指数为0.520，敏感性为57.9%，特异性为94.1%。Hosmer-Lemeshow χ2统计量为3.030（P = 0.932 > 0.05），表明模型校准良好，临床风险预测可靠。

伴有LNM的宫颈癌患者多部位微生物群落的功能通路改变

功能预测分析显示，仅在两组患者的尿液微生物组中观察到KEGG通路的统计学显著差异。七个KEGG通路在两组间存在显著差异，包括聚糖生物合成与代谢、转录、翻译、细胞生长与死亡、免疫系统和消化系统等。

讨论

本研究首次探讨了宫颈癌患者多器官微生物组与其淋巴结转移状态之间的潜在关联。数据揭示了LNM组患者多部位微生物相对丰度和组成的改变，并基于特异性口腔菌群构建了用于判断宫颈癌患者LNM状态的预测模型。

阴道菌群失衡与宫颈癌发展的关系已被广泛研究。随着宫颈病变进展，阴道菌群多样性增加，乳杆菌丰度持续下降，而加德纳菌属、普雷沃菌属等多种致病菌显著增加。阴道菌群失调可能通过破坏阴道黏膜上皮完整性、介导HPV感染、创造促炎环境以及影响免疫调节等机制诱导宫颈癌发生。

肠道微生物组作为人体微生物的主要栖息地，其与阴道菌群存在双向通讯，肠道菌群可能作为阴道病原体的储存库。宫颈癌患者与健康女性的肠道微生物组存在差异，并且肠道菌群失衡可通过调节雌激素水平、调控炎症反应、干扰碳水化合物代谢等多种机制与肿瘤发生发展相关联。

本研究发现口腔菌群中的葡萄球菌属、Erysipelotrichaceae UCG-003 sp.和霍氏真杆菌群是宫颈癌患者发生LNM的独立影响因素。研究表明，葡萄球菌可能参与人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染和宫颈癌发展。Erysipelotrichaceae UCG-003 sp.和霍氏真杆菌群在其他癌症中被报道与代谢调节和疾病状态相关，但它们在宫颈癌发生发展中的作用尚需进一步研究。

近年研究阐明了微生物组促进肿瘤转移的机制。例如，特定瘤内菌群可通过重塑细胞骨架增加循环肿瘤细胞对血管内机械应力的耐受性；结直肠癌原发灶和转移瘤的细菌谱高度一致，微生物随肿瘤细胞共同转移；产肠毒素脆弱拟杆菌（Enterotoxigenic Bacteroides fragilis）可促进乳腺癌的侵袭性进展和转移；具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）可通过影响宿主细胞表观遗传修饰等途径增强癌细胞的侵袭能力。

本研究证实宫颈癌患者多部位细菌菌群失调与LNM的发生相关。口腔微生物生物标志物具有非侵入性检测的优势，适用于大规模宫颈癌LNM筛查和随访。将微生物组学整合进宫颈癌诊疗体系，在提高筛查准确性、优化治疗方案和改善患者预后方面具有巨大潜力，并为宫颈癌的精准医疗开辟了新途径。

局限性

本研究存在一些局限性。首先，未纳入所有患者的HPV感染信息，可能影响目标微生物组的临床适用性及生物标志物预测效能的评估。其次，未考虑饮食类型对微生物组的潜在影响，可能影响预测模型的普适性。最后，单中心设计和样本量较小限制了结果的外推有效性和模型的稳定性，需要进一步扩大样本进行验证。

结论

本研究揭示了伴有LNM的宫颈癌患者存在多部位微生物群失调的特征。基于口腔特异性菌群构建的预测模型能够区分伴有和不伴有LNM的宫颈癌患者，从而为临床工作提供了新的诊断思路，为宫颈癌的个性化治疗提供了新的见解，也为该领域的研究人员提供了重要的资源。