《Pest Management Science》：A new method to measure EC50 reveals cultivar-specific fungicide resistance and very high diversity within experimental field populations of Zymoseptoria tritici
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本研究开发了一种基于刃天青（RZ）染料和图像分析的高通量新方法，用于精准测量小麦叶枯病菌（Zymoseptoria tritici）对杀菌剂的半最大效应浓度（EC50）。研究通过对田间实验种群的大规模分析，首次直接证实了寄主-杀菌剂-病原体（H-F-P）相互作用的存在，并发现抗病性较强的小麦品种更易选择出具有较高杀菌剂抗性的病原菌株。这一发现对制定可持续的病害综合治理（IPM）策略、延缓杀菌剂抗性进化具有重要指导意义。
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Fungal material and field experiment
研究在瑞士苏黎世联邦理工学院Eschikon实验站进行了一项重复田间试验，评估了335个精英冬小麦品种在田间条件下对小麦叶枯病的定量抗性。所有小麦品种均被当地的Z. tritici种群自然侵染。试验小区在生长季节接受了三次不同杀菌剂混合物的处理。从每个小区的感病叶片上随机采集显示叶枯病症状的叶片，分两个时间点进行采样。通过对扫描图像的分析，测量了病斑覆盖叶面积百分比、病斑内分生孢子器密度和叶面积分生孢子器密度，作为对叶枯病抗性的定量指标。在根据对叶枯病的定量抗性对所有335个品种进行排序后，选择了17个代表整个叶枯病抗性范围的品种用于病原菌分离。从这些叶片中分离出Z. tritici，并在酵母蔗糖肉汤中培养后，将高浓度的芽生孢子保存在硅胶中，于-80°C下长期储存，供后续使用。
2.2 Microtiter plate assays
杀菌剂效果测试在无菌96孔微孔板中进行。每个Z. tritici分离物以相同的孢子浓度添加到含有七种不同浓度杀菌剂的酵母蔗糖肉汤培养基的孔中，并设一个不含杀菌剂的对照孔。在加入芽生孢子之前，将稀释的刃天青染料加入YSB-杀菌剂混合物中。每个分离物在不同的微孔板中重复三次。每个板包含一个不接收任何芽生孢子的对照列。平板用Parafilm密封，贴上唯一的QR码标签，在18°C、60%相对湿度的黑暗条件下培养7天，以尽量减少液体蒸发。培养结束后，使用平板扫描仪以600 dpi的分辨率扫描平板和相关的QR码。
2.3 Calibration of RZ
刃天青染料被溶解并灭菌至终浓度。使用两个随机选择的Z. tritici菌株进行校准实验，测试了12种不同的RZ浓度和8种不同的芽生孢子浓度组合。目标是确定能够检测最大颜色变化范围（从蓝色到红色）的最低RZ浓度，作为真菌代谢活动的指标。在不同时间点扫描平板，测量由真菌代谢产生的红色强度。通过方差分析揭示了芽生孢子浓度和RZ浓度之间的显著差异，但重复间无显著差异。最终选择168小时作为最佳数据收集时间点，180 mg L-1的RZ浓度和8 × 105spores mL-1的孢子浓度作为测量杀菌剂敏感性的最佳条件。
2.4 Measuring fungicide efficacy
使用刃天青作为每个孔中Z. tritici生长量的代谢指标，通过数字图像分析测量诱导的红色。测试了六种活性成分，包括田间试验中应用的五种以及丙环唑。每种杀菌剂的系列稀释度覆盖微孔板中的一列，共八个浓度。选择的杀菌剂浓度范围旨在使真菌分离株在低浓度下能够有一定生长，同时在最高浓度下达到不生长或最小生长。在分析了所有分离物的完整数据集后，对部分需要调整浓度范围以确定其EC50值的分离物进行了重新测试。
2.5 Analyzing the digital images
创建了一系列脚本和ImageJ宏来创建和读取QR码，根据平板名称对图像进行排序，并分析每个微孔板每个孔中的红色强度。红色强度被用作每个孔中真菌生物量的代理指标。修改了现有的用于读取微孔板红色强度的宏。基于每个孔在板中的位置，可以分析红色强度值作为杀菌剂浓度的函数。
2.6 Comparison of biomass values calculated using RZ and OD measurements
选择了22个菌株，直接比较使用新RZ方法计算的生物量值与使用传统OD测量方法获得的值。OD测量在Tecan Infinite平板阅读器上于570 nm波长下进行。使用简单线性回归模型评估了RZ和OD计算的生物量值之间的相关性，提供了相关系数和P值。
2.7 Calculation and analysis of EC50values
EC50值是通过应用四参数非线性模型，基于每个分离物在八个浓度下的生长情况计算得出的。使用SPSS软件测量重复间的EC< />相关性。其余分析和结果绘图使用R软件进行。EC50值进行了归一化和对数转换，以满足线性模型的假设。使用两种方法研究采集时间、寄主品种和活性成分对EC50值的影响。在拟合线性模型并进行方差分析后，使用最小显著差法进行多重比较，并使用Bonferroni校正对P值进行多重检验校正。
2.8 Broad-sense heritability
为了估算广义遗传力，使用了线性混合效应模型和方差分割。在LME中，响应变量是对数转换和归一化的EC50值，采集时间是拟合因子，随机因子是寄主品种、活性成分、重复和分离物。提取方差分量并用于计算H2。
2.9 Correlation between cultivar resistance to STB and fungicide sensitivity
使用三个定量抗性指标评估了每种活性成分的EC50值与每个小麦品种对叶枯病的抗性程度之间的相关性。使用R软件计算Pearson相关性。
3 RESULTS
3.1 Developing a digital image analysis pipeline
含有刃天青的微孔板显示出不同的颜色梯度，反映了每个分离物在每个活性成分系列稀释度下的累积生长。每个平板中未接种的对照列在整个实验过程中保持蓝色，所有八个浓度均未显示任何颜色变化。测试了12种不同的RZ浓度，并在1至168小时的培养时间内测量了红色分值。发现两种测试分离物的RZ浓度之间存在显著差异。选择180至200 mg L-1之间的浓度作为覆盖红色光谱显著部分的最低RZ浓度。颜色密度随时间变化。在接种后1至120小时期间可见多个峰值，但在144小时出现单峰，而在接种后168小时出现的峰值显示出更接近正态的分布。因此选择接种后168小时作为最佳数据收集时间点。方差分析显示芽生孢子浓度和RZ浓度之间存在显著差异，但重复间未发现显著差异。最终选择168小时培养时间、180 mL L-1的RZ和8 × 105blastospores per mL作为测量杀菌剂敏感性的最佳条件。
3.2 Measuring fungicide sensitivity
同一分离物的重复在不同杀菌剂浓度下显示出相同程度的红色强度。比较了生物学重复的EC50值以检查方法的可重复性。使用SPSS中的贝叶斯模型计算线性回归，得到的R2范围在0.98至0.99之间。对22个分离物使用新RZ方法计算的生物量值与常规OD方法进行了直接比较，相关性很高。所有活性成分的EC50数据集之间发现了显著的成对相关性，但丙环唑、环氧菌唑和metconazole之间的相关性最高，表明这些DMI之间可能更容易发生交叉抗性。EC50值分别针对C1和C3采集的分离物计算，平均值范围分别为：bixafen为0.39 mg L-1，epoxiconazole为24.7 mg L-1，metconazole为17.99 mg L-1，propiconazole为26.79 mg L-1，prothioconazole为18.29 mg L-1，spiroxamine为4.34 mg L-1。方差分量分析确定了与EC50值相关的显著广义遗传力。
3.3 The effects of collection time on EC50
第一次采集的EC50值显著高于后期采集，这种模式在大多数活性成分中都存在。当使用每个重复的EC50时，除spiroxamine外，所有活性成分的第一次采集EC50均显著较高。当使用重复间的平均EC50时，采集时间的影响对除spiroxamine和prothioconazole外的所有活性成分均显著。因此，在模型中包含了采集时间以控制这些差异。
3.4 The effects of H–F–P interactions on EC50
病原菌分离物来自17个具有不同叶枯病抗性的寄主基因型。当合并所有活性成分的数据时，发现了显著的H-F-P相互作用：寄主、活性成分及其交互作用解释了每个分离物EC50变异的显著部分。当分别考虑每种活性成分并将每个重复作为一个观察值时，发现所有活性成分的EC50都随寄主品种而异。单个品种寄宿的分离物对某种活性成分的EC50值显著高于其他品种。如果使用重复间的平均值，观察到的显著寄主差异较少。接下来，测试了每个品种某种活性成分的平均EC50与该品种平均叶枯病抗性程度之间的关联。发现在18个比较中，有14个显示平均EC50值与每个品种的平均叶枯病感病性之间存在负相关，但其中只有3个具有统计学显著性。
4 DISCUSSION
4.1 RZ dye in microtiter plates provides a new method for measuring EC50values in Z. tritici
在胁迫下，Z. tritici菌株经常增加黑色素产生并从芽生孢子生长转变为菌丝生长。这两种过程都会影响基于真菌孢子溶液光密度的生长测量，因此开发了一种不同的方法，测量整体代谢活动作为真菌生长的代理指标。微孔板中的杀菌剂敏感性基于刃天青从蓝色到红色的颜色转换，这与总代谢活动相关。该方法提供的定量EC50测量值受生长类型或胁迫下黑色素产生的影响较小。该方法是半自动的，不易出现人为错误，并且具有分析图像可以存档的优点。仅对22个测试菌株比较了RZ和OD方法，发现每个孔指示的生物量之间存在高度相关性，表明新方法提供的结果与旧方法基本一致。
4.2 A high diversity of fungicide sensitivities was maintained within a field population over time
本实验中取样的自然田间Z. tritici种群即使在经过三次杀菌剂应用的选择循环后，仍保持了杀菌剂敏感性表型的极高多样性。尽管存在强烈的杀菌剂选择，但没有证据表明随着时间的推移杀菌剂抗性水平增加。EC50值在这个自然感染的田间单次生长季节内跨越了2到4个数量级。在这个田间单次生长季节内发现的EC50值范围与相同杀菌剂在4年期间分布于欧洲的55个田间试验点发现的范围相似。这种高多样性在未暴露于杀菌剂选择的自然种群中是预期的，但在暴露于三次全推荐剂量杀菌剂喷雾的田间种群中比预期要高得多。所有三次应用都由杀菌剂混合物组成，这是一种被广泛推荐的减少对抗性较高菌株定向选择的策略。认为使用杀菌剂混合物可能有助于该田间种群中保持高表型多样性，也可能有助于C3样本中未出现比C1样本更高抗性的情况。EC50值的密度分布对所有活性成分都遵循对数正态分布。在其他病原真菌的田间种群中也观察到了类似的杀菌剂抗性分布。值得注意的是，在预期会强烈选择杀菌剂抗性的环境中，在单个田间和单个生长季节内发现了类似的杀菌剂敏感性分布。这很好地说明了Z. tritici田间种群即使在经过几轮强选择后也能保持高进化潜力。认为有性生殖导致的重组有助于在这些经过处理的种群中保持高表型多样性和高进化潜力。EC50值显示出0.53的遗传力，与这些性状的潜在遗传基础一致。实验的三个重复之间发现了高度相关性，表明数据具有高度可重复性。丙环唑、环氧菌唑和metconazole的EC50值之间存在正相关和高相关性，为这些DMI之间的交叉抗性提供了证据。根据记录的每日温度和降水记录，估计在分隔C1和C3采样日期的43天期间发生了两个无性繁殖周期。在此期间进行了两次杀菌剂混合物处理。尽管有证据表明存在高遗传力以及可能进行两个周期选择的机会，但所有活性成分的平均EC50值在C1中均高于C3。这表明在C1之后发生的杀菌剂应用并未产生更具抗性的真菌种群。这一反直觉的发现出乎意料，接下来描述两种可能单独或共同作用来解释该模式的过程。
4.2.1 Process 1: Escape from selection
在这个过程中，相当一部分Z. tritici种群未暴露于足够高剂量的活性成分以杀死敏感菌株。任何杀菌剂的有效控制期在12至19天之间，具体取决于活性成分和温度。Z. tritici是一种坏死营养型病原菌，它继续定殖被杀死的叶片组织以及自然衰老的叶片组织，并可以在下部衰老的小麦叶片上持续存在数月。假设施用到冠层上部三或四片绿色叶层的杀菌剂未在衰老的下部叶层中达到致死浓度。在这种情况下，下部叶层中由杀菌剂敏感分离物产生的子囊孢子和分生孢子孢子将能够在处理的上部叶层中杀菌剂浓度降至致死水平以下后引发新的感染。
4.2.2 Process 2: High gene flow from untreated populations
在这个过程中，大量来自附近未使用杀菌剂处理的小麦田的气传子囊孢子，在C1和C3之间将高频的杀菌剂敏感菌株引入试验小区上部叶层，稀释了被选择的杀菌剂抗性菌株。早期研究报告称，未处理的麦田保存的Z. tritici种群比从杀菌剂处理田分离的种群具有更低的EC50值。先前的研究表明，来自田外和田间下部叶片的气传子囊孢子都可以在叶枯病流行后期为上部叶层提供重要的接种体来源。
4.3 The H–F–P interaction
具有不同遗传背景和表现不同叶枯病抗性程度的小麦品种已知会直接影响感染的建立以及有性和无性繁殖的频率。在本实验中，我们发现了大量证据表明不同的寄主品种产生了表达不同杀菌剂敏感度的病原菌分离物种群；即存在显著的H-F-P相互作用。寄主对活性成分抗性的影响差异很大，在每种情况下，不同品种的子集彼此显著不同。几乎所有品种-分离物亚组对活性成分的抗性（以EC50值表示）都表现出差异行为，表明品种基因型与杀菌剂环境相互作用，选择出最适应的病原菌分离物。总体而言，发现每个品种的叶枯病抗性程度与从同一品种获得的病原菌分离物的杀菌剂抗性程度之间存在正相关关系，尽管相关性仅对metconazole和bixafen显著。这里重要的是，用于获得叶枯病抗性测量的叶片与用于获得病原菌分离物的叶片是相同的，因此相同的病原菌种群被用于进行寄主叶枯病抗性和病原菌杀菌剂抗性的测量。研究结果表明，平均而言，抗性较强的寄主会选择对杀菌剂具有较高抗性的病原菌分离物。这一模式首次在从同一未使用杀菌剂处理的俄勒冈州田间生长的抗病和感病小麦品种中分离的Z. tritici种群中被描述。在同一篇论文中，发现141个全球Z. tritici分离物的毒力与其对DMI cyproconazole的抗性之间存在显著相关性。作者提出具有多效性的基因可以解释这些相关性。具有解毒或外排抗病寄主产生的防御化合物能力的病原菌菌株可能也具有解毒或外排合成抗微生物化合物的能力，导致毒力和杀菌剂抗性同时增加。作者还提出病原菌可以产生防御性代谢物，这些代谢物可以破坏或修改天然和合成抗微生物剂的结构和功能。对其他Z. tritici菌株的表型分析发现了杀菌剂敏感性与毒力之间的适应性权衡。尽管早期的实验并非旨在测试H-F-P相互作用，但它们为可能促成推定的H-F-P相互作用的广泛机制提供了证据。本文报告的新数据集来自一个旨在测试H-F-P相互作用的实验。结果表明，不同的寄主选择性地偏爱携带对不同杀菌剂抗性的病原菌分离物。这类信息最终可能有助于确定应对哪些品种施用哪些杀菌剂以降低出现杀菌剂抗性的风险。
5 CONCLUSIONS
实验表明，即使在经过三次杀菌剂混合物处理后，高变异性的杀菌剂敏感性仍可以在田间尺度的病原菌种群中保持。平均而言，抗病性较强的小麦品种选择了具有较高杀菌剂抗性的病原菌菌株。有强有力的证据表明存在寄主-杀菌剂-病原体相互作用，其中特定的寄主基因型选择了对特定活性成分更具抗性的病原菌菌株，这表明某些寄主品种可能会加速对一些杀菌剂抗性的出现。
