《Plant Biotechnology Journal》：OsMT2b Regulates Pollen Development and ROS Homeostasis in a Photoperiod-Dependent Manner
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本文发现水稻金属硫蛋白基因OsMT2b通过清除活性氧（ROS）维持花药ROS稳态，其表达受光周期调控。在长日照（LD）条件下，OsMT2b表达下调导致ROS过量积累，引发绒毡层程序性细胞死亡（PCD）提前启动且降解延迟，最终导致花粉败育；而在短日照（SD）条件下育性恢复。该研究为利用OsMT2b创制光周期敏感型雄性不育（PGMS）系、应用于两系法杂交水稻育种提供了新种质资源和理论依据。
OsMT2b调控花粉发育和ROS稳态的光周期依赖性机制
摘要
活性氧（ROS）作为信号分子在动植物程序性细胞死亡（PCD）中发挥重要作用，但其在水稻花药发育中的具体功能尚不明确。本研究通过RNA干扰技术降低粳稻品种中花11的金属硫蛋白基因OsMT2b转录水平，导致结实率显著下降。半薄切片观察发现，与野生型相比，OsMT2b-RNAi植株的绒毡层降解启动早、结束晚。硝基蓝四唑染色和过氧化氢含量测定显示转基因植株花药中ROS含量升高。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记检测表明，绒毡层异常PCD导致小孢子不育。值得注意的是，OsMT2b-RNAi植株对光周期敏感：在自然长日照条件下不育，而在自然短日照条件下几乎完全可育，表明OsMT2b将光周期信息整合到花粉发育调控中。该水稻材料的发现为两系法杂交水稻育种丰富了种质资源。
材料与方法
以中花11为野生型对照，利用RNAi和CRISPR/Cas9技术构建OsMT2b敲除和多重突变体。通过石蜡切片、半薄切片观察花药发育，采用TUNEL法检测PCD，NBT染色和H2O2测定试剂盒分析ROS水平，RT-qPCR检测基因表达。光周期处理设置9小时、13小时和15小时光照，温度处理梯度为22°C至32°C。
结果
1. OsMT2b下调导致结实率降低和花粉发育异常
OsMT2b-RNAi株系结实率显著降低至5.3%-6.9%，花药干瘪苍白，花粉粒形态异常且碘液染色呈黄褐色。RT-PCR证实转基因植株中OsMT2b转录水平下降。
2. OsMT2b-RNAi植株表现为光周期敏感型雄性不育
在短日照条件下，转基因植株育性恢复正常，花药形态和花粉活力与野生型无差异；而在长日照条件下出现典型雄性不育表型。田间补光实验证实长日照诱导不育现象。
3. OsMT2b表达模式分析
OsMT2b在花药发育各阶段均有表达，后期阶段表达量更高。其表达受光周期调控，在15小时长日照下表达最高，随光照时间缩短而下降，但不受温度变化影响。
4. 绒毡层发育异常导致花粉败育
半薄切片显示，转基因植株花药绒毡层在S5阶段即出现不均匀增厚，降解进程迟缓，至S11阶段仍保持完整状态，导致小孢子发育异常和花粉败育。
5. 长日照下绒毡层PCD异常
TUNEL检测发现，野生型绒毡层PCD信号在S8阶段最强，S10阶段完全消失；而转基因植株PCD信号在S7阶段提前出现，并持续至S12阶段，表明PCD进程紊乱。
6. ROS含量异常
NBT染色和H2O2含量测定显示，转基因植株花药从S5阶段即出现ROS过量积累，且持续到发育后期。切片染色证实ROS主要积累在绒毡层和小孢子母细胞。
7. 花药发育相关基因表达变化
RT-qPCR分析显示，OsUDT1、OsTDR1、OsEAT1等17个花药发育关键基因在转基因植株中表达下调，表明OsMT2b参与花药发育调控网络。
8. 短日照条件下的表型恢复
在短日照条件下，转基因植株花药发育、ROS水平和PCD进程均恢复正常，与野生型无显著差异。
9. 基因编辑验证OsMT2b功能
OsMT2b单敲除株系在长日照下结实率降至48%-53%，而OsMT2a/2b/2c三敲除株系表现为完全雄性不育，花药白色弯曲，无活性花粉。ROS测定显示多重突变体花药和旗叶中H22含量显著升高。
10. OsMT2b功能的亚种间保守性
3000份水稻基因组数据分析表明OsMT2b编码区高度保守，在粳稻和籼稻中表达无显著差异，表明其功能在亚种间具有保守性。
讨论
ROS触发绒毡层PCD：本研究提出OsMT2b通过清除ROS维持花药ROS稳态，确保绒毡层适时PCD和正常花粉发育。OsMT2b下调导致ROS积累，引发PCD提前启动和延迟终止，最终导致花粉败育。
ROS水平与PCD终止：持续高ROS水平可能延迟绒毡层降解，这与dtc1突变体低ROS延迟PCD形成对比，表明ROS稳态对PCD时序调控至关重要。
光周期敏感不育系的应用前景：OsMT2b相关材料在长日照下不育、短日照下可育的特性，为两系法杂交水稻育种提供了新种质资源。相较于温度敏感型不育系，光周期敏感型不育系受环境波动影响更小，具有更好的应用稳定性。三敲除突变体的创制为培育完全雄性不育系奠定了基础。
