磷脂水解与矿化的多步机制：量子化学计算与实验分析揭示早期骨形成关键路径

《Journal of Materials Chemistry B》：Multi-step mechanisms of early phospholipid hydrolysis and mineralisation unveiled through combined quantum chemical calculations and experimental analysis

本研究通过结合量子化学计算与实验分析，首次系统揭示了磷脂酰丝氨酸（PS）相较于磷脂酰胆碱（PC）在骨形成初期具有更强矿化能力的分子机制。文章重点阐明了PS分子中丝氨酸头基的NH3+基团通过其不稳定的质子（H+）促进磷酸二酯键水解，形成五配位磷中间体，从而降低反应能垒，加速矿化启动的过程。这一发现为设计新型骨再生诱导分子提供了关键理论依据。

　　

引言

磷脂是细胞膜的关键成分，并在骨和牙齿形成的初始阶段作为矿化的成核位点。其中，磷脂酰丝氨酸（PS）被证明比磷脂酰胆碱（PC）具有更强的矿化能力，但其背后的分子机制尚不明确。本研究旨在通过实验方法和计算化学相结合的手段，比较PS和PC的矿化过程，并重点探究水解作为关键初始步骤在磷脂介导的矿化中的作用机制。

实验方法

矿化实验

研究使用L-α-磷脂酰丝氨酸（PS）和L-α-磷脂酰胆碱（PC）进行体外矿化实验。将磷脂溶液滴加在玻璃培养皿上干燥后，覆盖氯化钙（CaCl₂）溶液，在37°C、5% CO₂条件下孵育。通过原子吸收光谱（AAS）定量分析沉积的钙含量，并使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）观察矿物形貌和元素组成。

计算方法

为阐明反应机理，研究采用结合神经网络势（Matlantis软件中的PreFerred Potential, PFP）和密度泛函理论（DFT，使用Gaussian16软件，B3LYP/6-31G(d,p)理论水平）的计算策略。首先利用PFP快速定位势能面上的驻点（反应物、过渡态、产物），随后通过DFT计算进行结构优化和振动频率分析，以获得更精确的能量信息（使用APFD/6-311+G(2d,p)水平进行单点能计算）。计算考虑了水溶液环境（极化连续介质模型PCM）。为简化计算，使用截短碳链（6个碳）的磷脂模型PS6和PC6来代表实际的PS和PC。

结果与讨论

实验结果

AAS分析显示，在2 mM CaCl₂溶液中孵育2天后，PS诱导沉积的钙含量显著高于PC。SEM图像显示PS形成的矿物颗粒更大、更不规则且聚集程度更高，而PC形成的矿物簇则相对较小且呈球形。EDS分析表明两者的Ca/P比值均较低（PS约0.3，PC约0.35），提示为早期的贫钙无定形矿物相。在不同pH（6.5, 7.5, 8.5）条件下，PS的矿化能力均显著高于PC，且在更高pH下PS矿化增强，表明其功能基团的质子化状态可能影响Ca²⁺结合和矿化过程。

计算结果：PS6与PC6的水解机制

计算揭示了磷脂水解遵循形成五配位磷（五氧磷烷）中间体的机制。对于单个PS6分子，水解可通过两条主要路径（R1和R2）进行。R1路径优先水解磷酸基与丝氨酸（P–O_ser）之间的键，R2路径则优先水解磷酸基与甘油骨架（P–O_gly）之间的键。计算表明，R1路径的活化自由能（36.0 kcal mol^-1）低于R2路径（41.3 kcal mol^-1），表明PS6更倾向于先水解掉丝氨酸。其关键原因在于PS6丝氨酸头基的NH₃⁺基团中存在一个不稳定的质子（H⁺），该质子易于转移至即将断裂的P–O键的氧原子上，从而显著促进水解反应（过渡态见图6）。相比之下，PC6分子缺乏类似的易转移质子，其水解活化能较高（P–O_cho水解为38.8 kcal mol^-1），且其脂肪链与甘油骨架之间的C–O键水解能垒（32.8 kcal mol^-1）相对较低，意味着PC可能更先发生脂肪链的水解。

Ca²⁺离子的影响

当存在Ca²⁺离子时，PS6的水解行为发生变化。Ca²⁺与PS6磷酸基团的结合较弱（P–Ca距离约3.71 ?），但会使P–O_gly键的水解（R2路径）变得更容易（活化能降至35.7 kcal mol^-1）。而对于PC6，Ca²⁺与其结合更强（P–Ca距离约2.99 ?），并对水解有轻微的促进作用。

磷脂-Ca²⁺-磷脂复合物体系

为模拟更接近实际的情况，研究构建了PS6–Ca²⁺–PS6和PC6–Ca²⁺–PC6复合物模型。在该体系中，PS6的水解活化能显著降低（例如P–O_ser1水解降至28.1 kcal mol^-1），且一个PS6分子的NH₃⁺基团上的质子甚至可以协助水解邻近PS6分子的P–O键。这导致矿化位置可能发生变化：优先水解甘油端（P–O_gly）会释放出亲水的ser–pho–Ca²⁺–pho–ser单元到溶液中促进溶液内矿化；而优先水解丝氨酸端（P–O_ser）则使磷酸基团保留在基底表面促进界面矿化。水解后释放的丝氨酸（含NH₂基团）可作为质子受体，这可能解释了PS矿化在较高pH下增强的现象。对于PC6–Ca²⁺–PC6复合物，其水解序列更可能是先水解两个胆碱头基，且脂肪链水解的竞争依然存在，可能导致大的亲水块状物释放到溶液中，与实验观察到PC溶液浑浊的现象一致。

结论

本研究通过实验与理论计算相结合，揭示了PS优于PC的矿化能力源于其丝氨酸头基中NH₃⁺基团提供的易转移质子，该质子能有效降低磷酸二酯键水解的活化能垒，从而启动更高效的矿化过程。此外，水解产物丝氨酸可能作为质子受体进一步促进后续反应。这些发现从分子层面深化了对磷脂介导生物矿化机制的理解，为设计模拟PS功能、促进骨再生的新型生物材料提供了重要的科学依据。