《Journal of Materials Chemistry B》：Visualisation of adjuvant penetration into plant waxes by fluorescence of Nile Red
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本综述创新性地利用环境敏感荧光团尼罗红（NR），通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）直接可视化并定量分析了农业佐剂在不同植物蜡质（如巴西棕榈蜡和小烛树蜡）中的渗透动力学。研究发现，蜡质组分对NR发射具有猝灭效应，而佐剂的渗透能显著减轻此猝灭，导致NR荧光强度和寿命增加。该方法为研究佐剂软化蜡质、促进农药渗透的机制提供了新工具，对优化农药制剂设计具有重要意义。
引言
植物表皮蜡是叶片最外层，具有防止水分过度流失、抵御紫外辐射和机械损伤等重要功能。然而，这层蜡质的强韧性也给农业带来了挑战，因为它会阻碍农药和除草剂等活性成分的渗透。现代农业化学中常使用含有软化佐剂的复杂制剂来增强药效，但其作用机制尚不明确。本研究报道了一种利用环境敏感荧光团——尼罗红来直接可视化佐剂在常见植物蜡中渗透的新方法。
材料与方法
研究使用了尼罗红、巴西棕榈蜡、小烛树蜡以及多种商业佐剂和乳化剂。通过吸收光谱、荧光光谱、时间相关单光子计数以及荧光寿命成像显微技术等多种手段，系统分析了NR在不同条件下的光物理性质。蜡样品的制备采用氯仿溶解、加热熔融并沉积于盖玻片上的方法，并通过控制冷却速率来获得不同形态的蜡质结构。
结果与讨论
佐剂渗透引起蜡中NR强度的变化
将含有尼罗红的巴西棕榈蜡样品暴露于含有Plurafac? LF431佐剂的水溶液中，一小时内即可观察到NR荧光强度显著增加，并形成网状亮纹结构。通过与其他特异性标记蜡质无定形相和晶相的分子的共定位实验证实，NR主要定位于蜡质的无定形相，且佐剂的渗透也发生在该区域。
佐剂渗透引起NR发射光谱和寿命的变化
与预期不同，佐剂的渗透并未引起NR发射光谱的显著位移，表明蜡质环境的极性变化很小。然而，FLIM分析显示，无论是稀释还是高浓度的佐剂处理，均能显著增加NR的荧光寿命。在未经处理的干蜡中，NR的寿命较短，表明其发射受到蜡质组分的猝灭。佐剂的渗透减轻了这种猝灭效应。
NR在体相溶剂中的发射
在多种体相溶剂中的测试表明，单纯的极性变化或粘度变化均无法完全解释NR在蜡中的短寿命现象。将NR溶于含有不同浓度蜡的氯仿溶液中，观察到其寿命随蜡浓度增加而单调下降，直接证实了蜡组分对NR的猝灭作用。
蜡结构对NR发射猝灭的影响
通过改变蜡样品的冷却速率可以调控其晶相与无定形相的比例。快速冷却的样品晶相尺寸减小，NR在其中表现出更长的寿命，表明猝灭效率与蜡的微观结构密切相关。不同种类的蜡也表现出不同的猝灭能力，例如小烛树蜡对NR的猝灭弱于巴西棕榈蜡。
可视化蜡内佐剂的传播
通过监测NR荧光寿命的z轴分布，可以清晰观察到佐剂在蜡层中的渗透过程。纯水或乳化剂Agnique? CSO40的处理对NR寿命没有影响，而Plurafac? LF431等佐剂则能引起显著的寿命增加，表明NR能特异性地响应具有软化蜡质能力的佐剂的渗透。
佐剂引起NR发射变化的机制
NR在水溶液中荧光很弱且易聚集，加入佐剂后，其被包裹于佐剂形成的胶束中，荧光强度和寿命大幅增加，发射峰蓝移。在蜡中，佐剂同样为NR提供了一个“保护性”微环境，使其免受蜡组分的猝灭。多种不同化学结构的佐剂均表现出类似的效果，证明了该方法的普适性。
NR与分子转子在可视化佐剂渗透中的比较
与之前使用的分子转子相比，NR的优势在于其荧光强度随佐剂渗透而增强，使得使用常规荧光显微镜即可进行可视化监测，无需复杂的FLIM设备。虽然分子转子能更精确地定量粘度变化，但NR作为一种廉价、易得的商业染料，在农用化学品筛选和研究中有更广泛的应用潜力。
结论
本研究证实尼罗红能有效嵌入植物蜡和干燥脂质膜中，且其荧光受到蜡质组分的显著猝灭。农业佐剂的渗透能够减轻这种猝灭，使NR的荧光“亮起来”。这一现象为利用常规荧光显微镜直观、便捷地监测疏水性农用化学品在植物蜡质中的渗透行为提供了新的技术手段。
