Snapin通过H2S依赖的CTSD S-硫磺化调控轻度创伤性脑损伤后神经元PANoptosis的机制研究

《Journal of Advanced Research》：Snapin mediates neuronal PANoptosis after mild traumatic brain injury via H 2S-dependent S-sulfhydration of CTSD

本研究针对轻度创伤性脑损伤（mTBI）后缺乏有效治疗策略的难题，揭示了Snapin蛋白通过结合胱硫醚β-合成酶（CBS）破坏H2S代谢稳态，进而降低pro-CTSD的S-硫磺化修饰水平，促进其成熟为活性CTSD，最终诱发神经元PANoptosis（泛凋亡）的新机制。研究证实干预Snapin/H2S/CTSD轴可显著改善神经功能缺损，为mTBI治疗提供了新靶点。

　　

当我们的大脑遭受轻微撞击时，表面可能看不出任何伤痕，但内部却可能掀起一场毁灭性的风暴。轻度创伤性脑损伤（mild Traumatic Brain Injury, mTBI）作为最常见的神经系统损伤类型，每年影响全球数千万人。尽管其名称带有"轻度"二字，但患者常常长期遭受认知障碍、情绪波动和运动功能下降的困扰。更令人担忧的是，目前临床上尚无特效药能够阻止损伤后神经细胞的进行性死亡，这成为康复路上的主要障碍。

传统研究多聚焦于细胞凋亡、焦亡和坏死性凋亡等单一死亡途径，然而近年科学家发现，在脑损伤等复杂病理环境下，这些死亡方式并非孤立发生，而是相互交织形成一种更复杂的"泛凋亡"（PANoptosis）模式。这种协同死亡机制可能正是导致神经细胞大规模丢失的关键。与此同时，溶酶体作为细胞内的"消化器官"，其蛋白酶cathepsin D（CTSD）的异常激活已被证实与多种神经退行性疾病相关。而气体信号分子硫化氢（H₂S）作为重要的神经保护因子，能否通过蛋白质翻译后修饰调控这些过程，成为值得深入探索的科学问题。

在这项发表于《Journal of Advanced Research》的研究中，苏州大学附属广济医院法医学系的陈雪石、黄欣琪等研究人员揭开了Snapin蛋白在mTBI后神经元死亡中的关键作用。他们发现，这个原本参与突触囊泡释放的蛋白质，在脑损伤后竟扮演着"死亡开关"的特殊角色。

为了揭示mTBI后神经细胞死亡的奥秘，研究团队建立了一套完整的研究体系。他们采用控制性皮质撞击（Controlled Cortical Impact, CCI）技术建立小鼠mTBI模型，确保损伤程度的标准性。通过腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）介导的基因敲降技术，特异性降低神经元中Snapin的表达水平。在分子机制层面，运用蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色、分子对接和免疫共沉淀等技术，深入解析蛋白质间的相互作用。特别值得一提的是，他们采用改良的生物素转换法检测蛋白质S-硫磺化修饰，并通过硫离子选择性电极精确测定组织内源性H₂S水平。在功能评估方面，研究团队设计了包括钢丝悬挂、旷场、新物体识别和莫里斯水迷宫在内的系列行为学测试，全面评估运动协调、焦虑样行为、识别记忆和空间学习记忆等神经功能。

Snapin表达在mTBI后损伤皮层和海马神经元中升高

研究首先发现mTBI后大脑皮层和海马体中Snapin蛋白表达呈现动态变化，在损伤后12小时至3天显著上调。免疫荧光染色证实这种升高主要发生在神经元而非胶质细胞中，提示Snapin可能特异性参与神经元对损伤的反应过程。

AAV-shSnapin抑制mTBI后的神经元PANoptosis

通过基因敲降技术降低Snapin表达后，研究人员观察到一系列重要变化：PANoptosis相关标志蛋白（包括NLRP3、caspase-1、GSDMD等焦亡相关蛋白，caspase-3、Bax等凋亡相关蛋白，以及RIP1、RIP3等坏死性凋亡相关蛋白）的表达均显著降低。免疫荧光双标染色进一步证实，神经元中caspase-3、GSDMD和RIP1阳性细胞数明显减少，表明Snapin敲降有效抑制了mTBI诱导的泛凋亡激活。

AAV-shSnapin改善mTBI引起的神经退行性变和长期神经功能障碍

行为学评估显示，Snapin敲降组小鼠在运动协调功能恢复、焦虑样行为改善、物体识别记忆和空间学习记忆等方面均表现优异。组织学分析发现，治疗组小鼠脑组织缺损体积显著减小，损伤周边区域星形胶质细胞（GFAP阳性）和小胶质细胞（Iba-1阳性）活化明显减弱，表明神经炎症反应得到有效控制。

Snapin结合CBS调控mTBI后H₂S稳态

机制探索发现，Snapin与H₂S合成关键酶胱硫醚β-合成酶（Cystathionine β-synthase, CBS）存在直接相互作用。分子对接和免疫共沉淀实验证实，mTBI后两者结合增强，但内源性H₂S水平反而下降。当使用H₂S合成抑制剂氨基氧乙酸（Aminooxyacetic acid, AOAA）处理时，Snapin敲降带来的保护效应被抵消，证明H₂S信号通路确实是Snapin下游的关键效应器。

H₂S通过抑制pro-CTSD的S-硫磺化减少CTSD成熟

深入研究H₂S的作用机制发现，mTBI后成熟CTSD（m-CTSD）水平显著升高，而其前体pro-CTSD的S-硫磺化修饰水平降低。外源性补充H₂S供体NaHS可恢复pro-CTSD的S-硫磺化，同时抑制m-CTSD的生成。值得注意的是，CTSD特异性抑制剂pepstatin A虽然也能抑制m-CTSD活性，但不影响S-硫磺化水平，提示H₂S是通过独特的翻译后修饰机制调控CTSD成熟。

抑制成熟CTSD减轻mTBI诱导的PANoptosis和神经退行性变

无论是药理学抑制CTSD活性（pepstatin A）还是外源性补充H₂S（NaHS），均能显著降低PANoptosis相关蛋白表达，减少退行性神经元数量。行为学测试进一步证实，这两种干预方式都能有效改善运动功能、缓解焦虑样行为、提升学习记忆能力，并减轻长期神经炎症和脑组织缺损。

这项研究首次阐明了Snapin-CTSD轴在调控mTBI后神经元死亡中的核心地位，揭示了H₂S依赖的蛋白质S-硫磺化修饰在这一过程中的关键作用。值得注意的是，Snapin在mTBI后的表达变化可能最初是细胞应对损伤的适应性反应，但在氧化还原失衡的微环境中，这种适应性反应转变为促进细胞死亡的危险信号。

从治疗视角来看，该研究提出了三种可能的干预策略：靶向Snapin本身、恢复H₂S稳态或抑制CTSD活化。特别是外源性H₂S补充展现出良好的治疗前景，因其能够同时调控多个关键节点，且H₂S本身已被证实具有神经保护作用。

这项研究的发现不仅为理解mTBI后次级损伤机制提供了新视角，更重要的是为开发针对性的治疗策略指明了方向。未来研究可进一步探索Snapin表达调控的上游机制，优化H₂S递送系统，以及验证这些发现在临床样本中的相关性，最终为mTBI患者带来新的治疗希望。