《Primates》：Revisiting the relationships among howler monkeys through molecular phylogenetic analysis (Primates; Atelidae; Alouatta)
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本研究针对吼猴属(Alouatta)系统发育关系长期存在争议的问题，通过整合24个分子标记（2个线粒体基因和22个核基因）对9个物种进行贝叶斯推断、最大似然法和分化时间分析。结果明确了该属分为中美洲和南美洲两大支系，揭示了南美洲支系内由大西洋森林/东部亚马逊物种（如A. guariba, A. belzebul, A. discolor）和A. caraya/A. seniculus复合体构成的两个单系群，并确认了亚马逊河两岸物种（A. discolor/A. belzebul; A. macconnelli/A. nigerrima）的密切关系，为理解吼猴在Plio-Pleistocene时期的分化提供了关键证据。
吼猴（Alouatta）作为阔鼻猴类（Platyrrhini）中分布最广的新大陆灵长类，从墨西哥南部一直延伸到阿根廷北部。然而，这个属的分类和系统发育关系长期以来充满了争议和困惑。早期的研究基于细胞遗传学、形态学或有限的分子数据，得出的结果常常相互矛盾。这种不确定性不仅影响我们对吼猴进化历史的理解，也给其物种保护策略的制定带来了挑战。许多吼猴物种正因为极端的栖息地丧失和改变而面临种群下降甚至局部灭绝的威胁，被世界自然保护联盟（IUCN）列为易危或濒危物种。因此，厘清吼猴属内的系统发育关系，对于理解这些灵长类的进化历程以及制定有效的保护措施都显得尤为重要。
先前的研究虽然支持吼猴属分为中美洲（跨安第斯）和南美洲（安第斯以东）两大支系，但关于南美洲支系内部的具体亲缘关系，特别是近年来被提升为物种级别的分类单元（如A. discolor和A. nigerrima）的系统位置，仍然存在诸多不确定性。这些不一致可能源于使用的分子标记数量有限、分类样本覆盖不全、分析方法差异，以及部分GenBank序列缺乏准确的地理和标本凭证信息。
为了解决这些悬而未决的问题，Danillo Figueiredo da Silva及其合作者在《Primates》期刊上发表了他们的最新研究成果。研究人员设计了一项更为全面的分析策略，他们选取了9种吼猴，利用24个分子标记（包括2个线粒体基因和22个核基因）构建数据集。通过贝叶斯推断（Bayesian Inference, BI）、最大似然法（Maximum Likelihood, ML）和分化时间估计等多种分析方法，旨在构建一个更可靠的吼猴系统发育框架，并估算主要分歧事件发生的时间。
关键技术方法
本研究的关键技术方法主要包括分子实验和生物信息学分析。研究人员从37只个体（涵盖6种吼猴及外群）的血液或肌肉组织中提取总DNA，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增24个分子标记（22个核基因，2个线粒体基因），并进行桑格测序。序列经ClustalW比对，使用Kakusan4为每个基因分区选择最佳进化模型。系统发育分析采用RAxML进行ML分析，MrBayes进行BI分析，BEAST在松弛分子钟模型下进行分化时间估算，并应用了四个化石校准点（如Stirtonia tatacoensis化石校准Atelidae科节点）以提高时间估计的准确性。
研究结果
1. 数据库特征与遗传距离
研究构建的合并数据集总长度为16,093 bp（核DNA 14,481 bp，线粒体DNA 1,612 bp）。线粒体标记比核标记显示出更高的变异位点和简约信息位点数量。基于Kimura 2-Parameter (K2P) 模型计算的合并数据遗传距离显示，吼猴物种间的平均距离约为0.017，其中A. discolor与A. belzebul的遗传距离最小（0.0028），而A. sara与A. pigra的遗传距离最大（0.0481）。线粒体DNA的遗传距离平均约为0.057，是核DNA平均距离（0.0075）的7倍多。
2. 系统发育分析
ML和BI分析结果一致，高度支持吼猴属（Alouatta）分为两大支系：南美洲支系和中美洲支系。南美洲支系内部又进一步分为两个得到良好支持的单系群：一个由A. guariba和A. belzebul复合体（A. belzebul和A. discolor）组成；另一个由A. caraya和A. seniculus复合体（A. macconnelli, A. nigerrima和A. sara）组成。A. belzebul和A. discolor关系密切，但A. belzebul的单系性支持度相对较低（Bootstrap 65%, PP 0.84）。中美洲支系包含A. palliata和A. pigra，二者为姐妹种关系，支持度均达到最大值。单独使用线粒体DNA或核DNA数据集进行分析时，在部分节点（如A. discolor的位置、A. sara在A. seniculus复合体中的位置）出现了拓扑结构不一致的情况，这可能是由于谱系分选不完全或基因渐渗所致，但合并数据集的分析结果被认为更能反映吼猴的分类和生物地理结构。
3. 分化时间
基于松弛钟模型的分化时间分析表明，吼猴属的早期分化时间约为560万年前（95% HPD: 3.99–6.83 Ma）。南美洲支系内部的初始分化发生在约447万年前（95% HPD: 3.68–5.34 Ma）。随后，A. belzebul复合体与A. guariba的分化发生在约382万年前（95% HPD: 2.50–4.91 Ma），而A. caraya与A. seniculus复合体的分离发生在约362万年前（95% HPD: 2.57–4.85 Ma）。大多数 speciation 事件发生在上新世（Pliocene）。最近的物种形成事件是A. nigerrima/A. macconnelli（约121万年前）和A. discolor/A. belzebul（约148万年前），均发生在更新世（Pleistocene）。
研究结论与意义
本研究通过整合多基因座（核基因与线粒体基因）数据和可靠的样本信息，为吼猴属提供了更清晰和稳健的系统发育框架。结果证实了吼猴属分为中美洲和南美洲两大支系，其分化可能与安第斯山脉的隆升导致的隔离有关。南美洲支系内部的两个主要类群（A. guariba/A. belzebul复合体 和 A. caraya/A. seniculus复合体）的形成，可能分别与亚马逊河的形成以及新近纪（Neogene）时期连接亚马逊和大西洋森林的森林廊道片段化等生物地理事件相关。研究确认了A. discolor和A. nigerrima作为独立物种的有效性，尽管它们与近缘种（A. belzebul和A. macconnelli）分化时间较近（更新世），且遗传距离较小。线粒体与核基因数据在某些关系上的不一致提示了可能存在复杂的进化历史，如杂交渐渗或不完全谱系分选。
这项研究显著增进了我们对吼猴属多样化历史的理解，澄清了长期存在的分类学不确定性，并将主要的分化事件与南美洲重要的地质和气候变化时期联系起来。研究结果强调，未来需要对吼猴属进行更广泛的分类学、地理分布和基因组水平的采样，以全面揭示其进化历程，这对于这些面临生存威胁的灵长类动物的保护也具有重要意义。
