《Photosynthesis Research》：Estimating the redox state of the plastoquinone pool in algae and cyanobacteria via OJIP fluorescence: perspectives and limitations
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本研究针对质体醌（PQ）库氧化还原状态（PQ-redox）检测中样品制备敏感、难以实时监测的瓶颈，系统评估了快速叶绿素a荧光诱导动力学（OJIP瞬变）在绿藻（Chlorella vulgaris）和蓝藻（Synechocystis sp. PCC 6803）中的适用性。研究发现基于J点相对荧光产额（VJ和VJ'）的OJIP法不仅能用于黑暗适应样品，还能反映光适应状态的PQ-redox变化，且经DCMU、甲基紫精（MV）、乙醇醛（GA）和KCN等处理验证可靠。该半定量方法为藻类和蓝藻光合生理研究提供了非侵入式、高效的工具，拓展了OJIP技术在光合作用研究中的应用范围。
在光合作用的能量转化过程中，质体醌（Plastoquinone, PQ）库作为连接光系统II（PSII）和光系统I（PSI）的关键电子载体，其氧化还原状态（PQ-redox）不仅是电子传递速率的“调节器”，更是细胞感知光环境变化、调控基因表达和代谢平衡的核心信号枢纽。然而，如何准确、实时地监测PQ库的“充电”程度（还原态）与“放电”程度（氧化态），一直是光合作用研究领域的难点。传统的高效液相色谱（HPLC）法虽能精确定量PQ和质体氢醌（PQH2）的绝对含量，但样品处理过程繁琐，且无法捕捉光照等条件下秒级甚至毫秒级的快速动态变化。因此，开发一种非侵入式、可实时反映PQ-redox的检测技术，对于理解藻类和蓝藻的光合调控机制具有迫切需求。
早在20世纪90年代，研究人员发现，当暗适应的光合生物被强光瞬间激发时，叶绿素a荧光强度会呈现一条典型的OJIP动力学曲线：从初始荧光（O点）迅速上升，在2毫秒左右出现J点（代表QA的还原），30毫秒左右出现I点（反映PQ库的再氧化瓶颈），约200毫秒达到峰值P点（与PSI受体侧限制相关）。其中，J点的相对荧光值（VJ= (FJ– FO)/(FM– FO)）被证明与PQ库的还原程度呈正相关。不过，这套方法此前多用于高等植物的叶片研究，且在光适应条件下的可靠性存在争议。那么，对于单细胞的绿藻和蓝藻，OJIP法是否依然适用？能否在光照条件下准确捕捉PQ-redox的波动？不同荧光仪器的测量结果又如何？这些问题亟待系统验证。
为此，由捷克科学院全球变化研究所的Tomas Zavrel领衔的国际团队，在《Photosynthesis Research》上发表了最新研究，通过对两种典型光合微生物——绿藻（Chlorella vulgaris）和蓝藻（Synechocystis sp. PCC 6803）的系统实验，评估了OJIP荧光技术在半定量评估PQ-redox方面的可行性与局限性。研究发现，在严格控制培养密度、饱和光强和检测参数的条件下，VJ（暗适应）和VJ'（光适应）参数能够可靠地反映PQ库的氧化还原状态变化，不仅适用于黑暗适应样品，还能捕捉光适应条件下PQ-redox的动态波动。这一方法有望成为藻类和蓝藻光合生理研究中的常规工具。
为开展研究，作者主要依托三种荧光仪（Multi-Color PAM、AquaPen和FL 6000）进行OJIP曲线测量，重点优化了饱和脉冲强度、培养密度等关键参数，以确保FJ点的准确识别。实验材料为在多重培养器（Multi-Cultivator）中 turbidostat 模式培养的Synechocystis和Chlorella，控制光强25 μmol photons m–2s–1，并设置空气和0.5% CO2两种碳源条件。通过分析VJ/VJ'参数在暗-光转换、DCMU（PSII电子传递抑制剂）、甲基紫精（MV，PSI电子受体）、乙醇醛（GA，CBB循环抑制剂）和氰化钾（KCN，终端氧化酶抑制剂）处理等一系列扰动下的响应，评估该参数对PQ-redox变化的指示能力。
技术优化与VJ参数验证
研究发现，准确测定VJ的关键在于使用足够强的饱和脉冲（SP）以快速还原QA，并采用低培养密度以减少荧光散射和重吸收。在三种荧光仪中，Multi-Color PAM和FL 6000因可调节检测器增益和偏移，在较宽培养密度范围内获得稳定信号；而AquaPen在较高叶绿素浓度（>0.6 mg Chl a L–1）时易出现检测器饱和。VJ值随SP光强增加而升高，随培养密度增加而降低，这一趋势在两种藻中均一致。
DCMU处理下的VJ变化
DCMU通过阻断QB位点抑制电子从QA向PQ传递。在暗适应细胞中，随着DCMU浓度（0.1 nM–20 μM）升高，OJIP曲线中的J点不断抬高，I、P阶段逐渐消失，VJ逐渐增至1，表明QA被完全还原，PSII反应中心关闭。此时PQ库因无法接受电子而处于氧化态，但OJIP法仅能反映PSII关闭状态，无法直接监测PQ-redox，需结合P700+再还原动力学等辅助手段。
暗-光转换过程中的VJ'动态
在暗-光转换（100 μmol photons m–2s–1）实验中，Chlorella在空气条件下显示VJ'先升后降，约1–2分钟达峰，反映CBB循环和FNR活化前PQ库的暂时性还原；而在高CO2条件下，VJ'变化平稳，说明碳同化加速缓解了PQ过度还原。相反，Synechocystis的VJ'在整个光照期间保持相对稳定，推测因其类囊膜上存在的细胞色素bd氧化酶（Cyd）和细胞色素c氧化酶（COX）等终端氧化酶（TOs）能持续氧化PQH2，缓冲了PQ-redox波动。
光下添加乙醇醛（GA）与KCN的效应
乙醇醛抑制CBB循环后，Chlorella的VJ'在120秒内升至1，表明PQ库被强烈还原；高CO2培养的细胞上升斜率较缓，最终稳定于0.95，说明碳供应充足时PQ库仍保持部分氧化。Synechocystis的VJ'增幅较小，再显TOs的缓冲作用。而添加KCN（抑制TOs）后，Synechocystis的VJ'在30秒内飙升至0.98，显著高于Chlorella，直接证明TOs在蓝藻PQ-redox调控中的主导作用。Chlorella中VJ'的缓慢上升可能与KCN对质体蓝素（PC）或CBB循环酶的非特异性抑制有关。
高光处理下的响应
当光强从25 μmol photons m–2s–1跃升至1,500 μmol photons m–2s–1时，两种藻的VJ'仅小幅增加（Synechocystis: 0.72→0.80; Chlorella: 0.53–0.56→0.73–0.81），动态范围变窄。这是因为高光下QA–大量积累，OJIP曲线更多反映PSII关闭状态，对下游PQ-redox变化的灵敏度下降。Synechocystis的VJ'变化较Chlorella平缓，可能与藻胆体解耦或橙胡萝卜蛋白（OCP）介导的非光化学淬灭（NPQ）有关。
本研究通过系统验证，肯定了OJIP荧光技术在半定量评估绿藻和蓝藻质体醌库氧化还原状态方面的实用价值。该方法的核心优势在于非侵入、实时且操作简便，尤其适合捕捉暗-光转换、碳供应变化、电子传递抑制（如DCMU、MV）和代谢扰动（如GA、KCN）等条件下的PQ-redox动态。研究还揭示了藻种间差异：蓝藻Synechocystis凭借类囊膜上的终端氧化酶，能有效缓冲PQ库的过度还原，维持较窄的PQ-redox波动范围；而绿藻Chlorella则更依赖CBB循环和PTOX（质体终端氧化酶）调节PQ-redox，对光强和碳源变化响应更为敏感。
当然，该方法亦有明确局限。首先，VJ/VJ'参数仅反映光活性PQ库（约占总量25–55%）的 redox 状态，非全池；其次，在高光或PSII严重关闭（如DCMU处理）时，动态范围压缩，准确性下降；再者，测量需严格标准化SP光强、培养密度和FJ点识别方法，否则数据难以跨平台比较。此外，蓝藻中藻胆体荧光、状态转换（State transition）等也会干扰FO和FM的测定，需通过远红光预照等手段校正。
尽管如此，这项研究为微生物光合作用研究提供了重要技术支撑。未来，结合突变体（如缺失TOs的Synechocystis）和多组学数据，OJIP法有望在藻类高光效育种、生物能源生产及环境胁迫生理等领域发挥更大作用。
