聚集诱导发射活性半萘荧光素：一类用于生物成像的新型呫吨烯发光团

《Nanoscale》：Aggregation-induced emission active seminaphthofluoresceins: a new class of xanthene luminogens for bioimaging

本文报道了首例具有聚集诱导发射（AIE）特性的半萘荧光素（SNAFL）炔丙基醚类发光团TPRP-SNAFL和DPRP-SNAFL。该研究通过合成修饰成功将传统聚集导致猝灭（ACQ）的呫吨烯类荧光团转化为AIE活性材料，并展示了其在有机溶剂中水分含量光学传感以及小胶质细胞线粒体成像等方面的应用潜力，为开发新型功能性生物成像探针开辟了道路。

　　

引言

呫吨烯类荧光染料（主要包括荧光素、罗丹醇和罗丹明）在化学生物学和医学领域应用已超过150年。荧光素因其优异的量子产率、低体内毒性以及pH敏感性而成为该类染料的杰出代表。然而，与绝大多数传统有机荧光团一样，呫吨烯类化合物已知会发生聚集导致猝灭（ACQ）现象，这严重限制了其在成像中的应用。2001年，唐本忠院士团队报道了首例聚集诱导发射（AIE）现象，彻底改变了这一领域。AIE活性化合物（AIEgens）的独特性质在从诊断成像到光电子学的多种应用中展现出巨大潜力。在生物成像领域，AIE发光团的影响被描述为具有独特的革命性。然而，尽管几乎所有类型的传统ACQ荧光团都已被研究以实现从ACQ到AIE的转化，但多产的呫吨烯家族却很大程度上被忽视了。2020年，Feng等人报道了简单的衍生化荧光素表现出AIE特性，颠覆了荧光素作为固定ACQ物种的传统认知，但此后进展有限。

实验部分

本研究合成了半萘荧光素炔丙基醚TPRP-SNAFL（1）和DPRP-SNAFL（2），它们是首个表现出聚集诱导发射行为的苯并[c]呫吨烯。合成方法是在无水条件下，使相应的半萘荧光素与炔丙基溴在丙酮中反应，经柱层析纯化得到目标产物。通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）对化合物结构进行了确证。光学性质通过紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量进行评估。细胞实验使用人HMC3小胶质细胞进行，评估了化合物的细胞摄取、亚细胞定位（与MitoTracker Deep Red和BODIPY 493/503共染色）、线粒体膜电位依赖性（使用FCCP解偶联剂）以及细胞毒性（MTT法）。

结果与讨论

合成与溶液光学性质

TPRP-SNAFL（1）和DPRP-SNAFL（2）在多种非质子有机溶剂中表现出高溶解性。在丙酮中，它们的吸收最大值分别在485 nm（ε = 21,500 M^-1cm^-1）和483 nm（ε = 21,800 M^-1cm^-1），发射最大值分别在561 nm和552 nm，表现出高达76 nm和69 nm的大斯托克斯位移，这有助于减少自淬灭和激发光源的干扰。与其中性形式的母体半萘荧光素相比，炔丙基醚化诱导了发射的红移。化合物在溶液态具有中等荧光量子产率（1: Φ_f= 0.11; 2: Φ_f= 0.14）。

聚集诱导发射特性

在丙酮/水二元溶剂体系中，随着水含量（f_w）的增加，两种化合物表现出典型的AIE行为。当水含量达到70%时，荧光强度达到最大，TPRP-SNAFL和DPRP-SNAFL的荧光强度分别增强了约3.5倍和3.7倍，量子产率分别提高至0.21和0.32，荧光寿命也相应延长。吸收光谱显示，随着聚集，在521 nm（1）和518 nm（2）处的吸收带强度显著增加。辐射衰减速率常数（k_r）在聚集态也相应提高，表明非辐射衰减途径受到抑制，这是AIE发光团的典型特征。

水分含量传感

由于化合物光学性质（吸收比和发射强度）在很宽的水含量范围（1-70%）内呈现线性变化，它们被成功应用于有机溶剂（如丙酮）中水分含量的光学传感。通过监测吸收峰比值（1: 521/485 nm; 2: 518/483 nm）或荧光增强因子（I/I₀），可以实现对水含量的定量检测。

聚集体的表征与调控

荧光显微镜和原子力显微镜（AFM）观察显示，在含水溶剂中，化合物形成平均尺寸约为25 nm的球形纳米颗粒，这些颗粒会进一步簇集成更大的聚集体。有趣的是，在纯醇类溶剂（如甲醇、乙醇）中，即使没有共溶剂，也能形成分散良好、发射强烈的聚集体，且光学性质优于水/丙酮体系。晶体结构分析表明，TPRP-SNAFL分子在晶体中具有高度扭曲的构象，芳环面之间存在偏移，避免了导致ACQ的面对面π-π堆积。分子间存在多种氢键相互作用，这有助于限制分子内旋转，可能与AIE效应相关。其AIE机制可能与限制进入暗态（RADS）有关。

细胞内成像应用

在人类HMC3小胶质细胞中，TPRP-SNAFL和DPRP-SNAFL的聚集体能够被细胞有效摄取，并在30-45分钟内达到最大荧光强度。共定位实验表明，尽管化合物本身为中性且不含经典的线粒体靶向基团，但其聚集体却主要定位于线粒体，与MitoTracker Deep Red有很高的共定位系数。使用线粒体解偶联剂FCCP降低线粒体膜电位（ΔΨ_m）后，化合物荧光强度的下降幅度远小于阳离子线粒体探针TMRE，表明其在线粒体的积累和滞留对膜电位的依赖性较低。这使其有望用于检测去极化（不健康或固定的）线粒体。化合物在浓度低于10 μM时对细胞数量和线粒体代谢活性影响较小。此外，研究还展示了化合物与脂滴（LD）探针BODIPY 493/503共标记，观察到了线粒体与脂滴的紧密相邻，为研究细胞器间相互作用提供了工具。化合物末端的炔基也为后续通过点击化学进行功能化修饰，实现长期成像提供了可能。

结论

本研究成功开发了一类新型的具有聚集诱导发射活性的半萘荧光素炔丙基醚发光团（TPRP-SNAFL和DPRP-SNAFL）。它们不仅实现了呫吨烯类荧光团从ACQ到AIE的转化，还兼具大斯托克斯位移、发射红移、可用于水分传感以及细胞器成像等多功能特性。作为首例应用于生物成像的AIE活性荧光素类探针，它们在小胶质细胞中展现出独特的线粒体靶向能力，且对膜电位依赖性较低，为研究线粒体形态、运动及其与脂滴等细胞器的相互作用，特别是在神经炎症和神经退行性疾病模型中的应用提供了新的 versatile 工具。这项研究为功能性呫吨烯AIEgens的进一步发展奠定了基础。