《Advanced Materials Technologies》：Advanced Mounting Technique for Improved Imaging and Analysis of Embedded Spheroids and Migrating Cells in Light Sheet Fluorescence Microscopy
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本文介绍了一种用于蔡司光片7显微镜的新型样品固定技术，该技术针对嵌入式三维（3D）肿瘤球体和迁移细胞的成像分析进行了优化。通过创新的样品固定器设计，实现了对胶原凝胶等易变形样本的稳定固定和双面照明（LSFM），显著提升了图像质量。结合优化的2,2′-硫代二乙醇（TDE）光学清除技术和Arivis Vision4D软件分析，文章详细展示了在三维细胞外基质（ECM）模型中研究癌细胞迁移、早期转移行为以及化疗（如SN-38）效应的完整工作流程，为癌症研究提供了更生理相关的成像平台。
引言
光片荧光显微镜（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）作为一种强大的三维成像工具，因其高分辨率、低光毒性和快速体积数据采集能力，在荧光标记生物样本的可视化中备受青睐。与传统宽场或共聚焦显微镜不同，LSFM通过薄层光片选择性照明样本，最小化离焦信号。然而，样本固定技术仍是LSFM应用的瓶颈，尤其是对于大型或易碎样本（如胶原凝胶中的肿瘤球体），常规方法（如毛细管固定）可能引入机械应力或限制实验灵活性。本文旨在解决这一挑战，开发了一种兼容蔡司光片7显微镜的新型样品固定器，专门用于分析嵌入胶原凝胶中的球体，支持双面照明，提升图像质量，并结合光学清除和先进图像分析，实现对细胞迁移和药物反应的精准量化。
优化TDE清除提升嵌入式球体成像效果
高质量三维成像依赖于有效的样本制备。本研究采用人卵巢癌细胞系ES-2-GFP形成的肿瘤球体，通过液体覆盖技术（Liquid Overlay Technique, LOT）制备，并于第4天嵌入胶原I基质中。为评估化疗影响，部分球体在嵌入后第1天用SN-38处理。二维亮场成像显示，未处理球体面积在3天内显著扩大（第3天比第0天增加约26.3倍），而SN-38处理组在第3天面积减少约3.3倍。但二维成像无法捕捉细胞在软基质中的复杂三维侵袭行为。
为克服胶原凝胶的光散射问题，研究优化了2,2′-硫代二乙醇（TDE）光学清除方案。通过测试不同浓度TDE（0%-80% [v/v]）对固定后胶原凝胶透明度的影响，发现60% [v/v] TDE能实现最佳光学透明度，其折射率（Refractive Index, RI）在宽谱白光下匹配良好。进一步波长依赖性RI测量显示，针对GFP表达的488 nm激发光，最佳RI为1.4535，显微镜物镜的焦点环据此设置为1.45。光片位置通过软件调整确保对齐。成像结果表明，经60% TDE清除的样本信噪比显著提升，细胞边界更清晰，三维重建和细胞分割准确性更高，为后续迁移分析奠定基础。
新型样品固定器实现平坦胶原固定与双面照明
针对胶原凝胶易损伤、折叠的特性，研究团队设计了由硬化钢制成的定制样品固定器。其核心为直径6 mm的圆形开口，可容纳直径10.3 mm的胶原凝胶，并通过氰基丙烯酸酯粘合剂固定样本边缘，避免凝胶变形。固定器浸入60% TDE溶液后，支持双面照明成像。与单面照明相比，双面照明有效补偿了凝胶内的残余光散射，使样本各区域细胞信号更均匀，避免了远离光源细胞信号弱或无法检测的问题。例如，单面照明时，橙色标记细胞（左侧照明）和青绿色标记细胞（右侧照明）分别仅在对应照明侧清晰可见，而双面照明则同时检测到两者，提升了细胞检测的完整性。
优化分割提升细胞检测精度
在图像分析阶段，分割阈值优化是关键。研究使用Arivis Vision4D软件，通过系统评估不同阈值对三维图像中细胞识别的影响。以嵌入后第1天的球体为例，阈值设置过低（如1）会导致背景噪声被误判为细胞（假阳性），而阈值过高（如8）则会漏检真实细胞（假阴性）。最终确定阈值3适用于第0天和第1天样本，阈值5适用于第3天及SN-38处理样本，确保分割准确性。优化后的分割为下游细胞计数、密度计算和迁移距离测量提供了可靠数据。
细胞分割分析揭示球体内增殖与迁移动态
应用优化后的成像系统分析ES-2球体在胶原中的行为发现，细胞从球体中心向周围凝胶多方向迁移。量化参数显示，从第0天到第1天，细胞数量无显著变化，但细胞密度（细胞数/球体体积）显著下降约2.5倍，表明早期迁移主导。第1天到第3天，细胞数量显著增加约2.9倍，细胞密度进一步下降（无显著性），说明增殖与迁移并存。迁移距离分析显示，细胞平均距离从第0天的132.4 μm增至第3天的275.8 μm，分布范围扩宽，峰值从第0天的140-160 μm移至第3天的240-260 μm，最远迁移距离达580-600 μm。
化疗显著抑制细胞数量与迁移
SN-38处理实验表明，化疗能有效限制ES-2球体发展。三维成像显示，处理组在第3天细胞数量比未处理组减少约2.5倍，平均迁移距离从275.8 μm降至176.1 μm，细胞分布集中在180-200 μm范围内，而未处理组分布更广（峰值240-260 μm）。细胞密度略有增加但无显著性，提示细胞向外迁移受限。这些结果与二维成像中球体面积减少一致，但三维分析提供了更全面的空间信息，证实SN-38将球体发展阻滞在近似第1天水平，而非完全摧毁细胞。
讨论与展望
本研究开发的新型样品固定器解决了LSFM中易变形样本（如胶原凝胶）的成像难题，通过支持双面照明和稳定固定，提升了图像均匀性和分析可靠性。结合TDE清除和RI匹配，工作流程实现了对三维微环境中细胞迁移和药物反应的高精度量化。与现有技术（如共聚焦显微镜）相比，LSFM在成像速度和深度上具优势，尤其适合大体积样本。未来方向包括采用透明水凝胶避免清除步骤，实现实时长期观测，以及适配多孔板格式提升高通量应用潜力。该技术为癌症研究、药物筛选及组织工程提供了强有力的工具。
