《Journal of Chromatography B》：An optimized HPLC-MS/MS assay for uracil and dihydrouracil in plasma: Improving dihydropyrimidine dehydrogenase phenotyping for individualized fluoropyrimidine treatment
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DPD酶表型分型新方法及临床应用验证。摘要：本研究开发并验证了一种基于HPLC-MS/MS的高灵敏度血浆尿嘧啶和二氢尿嘧啶同步定量方法，有效解决传统方法中色谱柱选择、矩阵效应及操作复杂度问题。方法采用PGC色谱柱结合脂质去除步骤，实现双标定量。与外部实验室对比显示线性关系良好（R2=0.998），但Bland-Altman分析提示存在±9.57 ng/mL的宽接受范围，需结合临床阈值判断。该方法为氟尿嘧啶化疗个体化剂量调整提供可靠生物标志物检测工具。
雅希亚·贝纳尼（Yahia Bennani）| 卡拉·切哈德（Carla Chehade）| 卡罗琳·萨默（Caroline Samer）| 蒂博·科斯勒（Thibaud K?ssler）| 奥雷利安·托马斯（Aurélien Thomas）| 尤瑟夫·达利（Youssef Daali）
瑞士日内瓦大学医院临床药理学与毒理学系
摘要
二氢嘧啶脱氢酶（DPD）是一种关键的一相药物代谢酶，负责分解氟嘧啶类化疗药物，如5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil）、卡培他滨（capecitabine）和替加氟（tegafur）。其活性存在显著的个体差异，这既与遗传多态性有关，也受环境因素影响。DPD活性降低会导致氟嘧啶暴露过量，可能引发严重甚至危及生命的毒性反应。尽管在开始氟嘧啶治疗前建议进行DPD检测，但目前尚未采用统一的分析方法，导致临床实践中的差异较大。基因分型具有高特异性，而表型分析则能同时考虑遗传和非遗传因素对酶活性的影响。在本研究中，我们开发并验证了一种高效液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）检测方法，用于同时定量人血浆中的内源性尿嘧啶（uracil）和二氢尿嘧啶（dihydrouracil），这两种物质是DPD表型分析的常用内源性生物标志物。样品制备包括使用脂质去除剂进行提取，随后在多孔石墨碳柱（100 × 2.1 mm，5 μm；Hypercarb?，Thermo Scientific）上进行色谱分离。验证过程符合国际标准，证明了该方法具有适当的选择性、灵敏度、线性、准确性和稳定性。该方法应用于28个人血浆样本，其尿嘧啶浓度结果与使用独立LC–MS/MS平台的外部实验室结果进行了比较。Deming回归分析显示在95%置信水平下无显著偏差，但在高浓度范围内存在低估现象（y = 0.63× + 4.86）。Bland–Altman分析显示平均差异为-0.02 ng/mL，但一致性范围较宽（-9.61至+9.57 ng/mL），这突显了分析变异性在临床决策阈值附近的影响。需要进一步研究以评估该方法在更大样本群体中的临床实用性，并评估其与DPD基因分型和临床结果的相关性和互补性。该方法为基于氟嘧啶的个性化化疗提供了有价值的分析工具。
引言
二氢嘧啶脱氢酶（DPD）是一种由DPYD基因编码的普遍存在的代谢酶，主要在肝脏中表达，负责约80%的氟嘧啶类药物的代谢，包括5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前体药物卡培他滨和替加氟[1]。这些药物每年用于治疗约两百万患有各种实体瘤（如结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌）的患者[2]、[3]、[4]、[5]。遗传性DPD缺陷已被确认为重要的医学问题，有10-40%的氟嘧啶治疗患者会出现严重并发症，包括胃肠道、心脏和神经系统问题[4]、[6]、[7]、[8]。此外，0.2-0.8%的患者会因毒性反应而死亡[4]、[6]、[7]、[8]、[9]。尽管监管机构建议在系统性氟嘧啶治疗前检测DPD缺陷，但目前尚未采用统一的分析方法，现有方法仍存在差异。现有建议指出，完全缺乏DPD功能的患者不应接受氟嘧啶治疗，而部分缺乏DPD功能的患者可能需要减少剂量[1]、[8]。为此，有两种主要的评估DPD功能的策略：基因分型和表型分析。
基因分型通过识别导致DPD缺陷的具体变异体来提供高特异性[8]、[10]、[11]。在高加索人群中，与DPD缺陷相关的主要变异体包括*2A (rs3918290)、p.D949V (rs67376798)、*13 (rs55886062) 和 HapB3 (rs75017182)。然而，这些变异体仅解释了约25%的严重氟嘧啶毒性病例，说明基因分型方法的敏感性有限，因为可能存在其他未知的变异体也会影响DPD活性[8]、[9]、[12]、[13]、[14]、[15]。此外，基因分型流程可能耗时较长，且不适用于紧急的临床决策[16]。
表型分析的优势在于能够全面评估DPD的酶活性，从而综合考虑遗传和非遗传因素的影响。传统上，DPD表型分析的金标准是在外周血单核细胞（PBMCs）中测量DPD活性，这种方法在文献中有广泛记载，并被认为能反映肝脏中的DPD活性[9]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。然而，该方法依赖于放射性标记的底物、复杂的样品处理和大量血液样本，不适用于常规临床应用[13]、[16]、[22]。因此，人们探索了更简单且更适合常规临床工作的替代表型分析方法，特别是通过测量血浆、血清或唾液中的尿嘧啶（uracil）或二氢尿嘧啶/尿嘧啶（dihydrouracil）代谢比值[9]、[14]、[16]、[23]。多项研究报道了尿嘧啶浓度与DPD活性、5-FU清除率和毒性风险之间的关联[8]、[12]、[16]、[24]，但也有研究认为二氢尿嘧啶/尿嘧啶比值可能更准确地反映酶活性[14]、[16]。然而，关于使用尿嘧啶或二氢尿嘧啶/尿嘧啶比值作为DPD表型分析的内源性生物标志物，已有研究指出其局限性和结果不一致性[12]。一些研究发现，尿嘧啶主要适用于识别与严重毒性相关的显著DPD缺陷，而在中度或非严重毒性情况下关联较弱[24]；其他研究则显示二氢尿嘧啶/尿嘧啶比值与临床结果之间的相关性有限或不一致[12]、[18]、[24]。这些差异可能归因于饮食因素、早期HPLC-UV检测方法的分析变异性、DPD活性的昼夜变化以及样品前处理条件（如离心延迟、抗凝剂选择和储存稳定性）的强烈影响[12]、[13]、[17]、[18]、[25]、[26]、[27]。尽管存在这些局限性，尿嘧啶仍是一个重要的临床生物标志物，可用于识别DPD缺陷明显的患者[1]。最近，Tafzi等人提出了一种结合尿嘧啶表型分析和5-氟尿嘧啶治疗期间药物监测（TDM）的集成LC-MS/MS策略，强调了内源性生物标志物和药物暴露监测在氟嘧啶剂量个体化和预防毒性方面的互补价值[28]。Chavani等人的研究进一步支持了这一观点，他们指出尿嘧啶和二氢尿嘧啶/尿嘧啶比值结合5-FU药代动力学监测，为预测治疗反应和减少毒性提供了合理框架[29]。因此，先前关于这种基于血浆的表型分析方法的不一致性似乎更多源于方法学问题而非生物学因素，这突显了开发稳健和标准化分析流程的必要性。
因此，已开发出多种生物分析方法来定量尿嘧啶和二氢尿嘧啶以进行DPD表型分析，但许多方法存在实际应用限制。Liem等人早期开发了一种半自动HPLC放射测定法，使用多孔石墨碳（PGC）柱评估淋巴细胞中的DPD活性。尽管该方法采用了创新的色谱技术，但仍依赖放射性标记的底物和离线放射性检测，限制了通量和临床应用[30]。随后，Galarza等人报道了一种基于反相C18色谱的HPLC-MS/MS方法，用于血浆和唾液中的尿嘧啶和二氢尿嘧啶定量。他们的流程包括硫酸铵蛋白沉淀和大量有机溶剂（3.5 mL）的液-液萃取，以及高温（60°C）下的蒸发，增加了样品处理的复杂性。此外，使用5-氟尿嘧啶作为内标可能会使已经接受氟嘧啶治疗的患者的数据解读变得复杂[14]。其他LC-MS/MS方法也依赖于反相色谱和简单的蛋白沉淀。例如，Jacobs等人开发了一种快速HPLC-MS/MS方法，使用HSS T3柱和同位素标记的内标（尿嘧啶-15N?和二氢尿嘧啶-13C?15N?）。虽然该方法分析上可靠且已在大型临床队列中成功应用，但仅依赖蛋白沉淀会增加基质相关离子抑制的影响，尤其是对于极性强的内源性物质（如尿嘧啶和二氢尿嘧啶）。Nikman等人开发了一种基于反相UHPLC-MS/MS的方法，实现了快速分析和临床应用。然而，与其他反相方法一样，这种方法对极性强嘧啶的保留效果有限，仍依赖于内标校正[27]。相比之下，基于PGC的LC-MS/MS方法在保留极性强嘧啶方面表现更好。Robin等人开发了一种完全自动化的PGC方法，使用CLAM?2030平台，具有出色的重现性和最小的手动操作需求，且血浆用量极少（20 μL）[31]。然而，这种方法需要昂贵的专用机器人设备，且色谱运行时间较长（约15分钟）[31]。van den Wildenberg等人也采用了PGC色谱和蛋白沉淀结合的方法，实现了尿嘧啶、二氢尿嘧啶、胸腺嘧啶和二氢胸腺嘧啶的同时定量[26]。
在本报告中，我们描述了一种稳健、灵敏且准确的HPLC-MS/MS方法，用于同时定量人血浆中的内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶，每种分析物均使用稳定的同位素标记物（尿嘧啶-d2和二氢尿嘧啶-d4）。该方法成功应用于28名患者的血浆样本。该流程的关键创新在于优化的样品制备步骤，结合了常规的液-液萃取和额外的己烷洗涤，有效去除了脂质，减少了基质效应和离子抑制，提高了分析的稳健性。此外，使用多孔石墨碳（PGC）色谱柱确保了对极性强嘧啶的强保留和选择性，克服了反相柱常见的局限性。通过解决先前研究中发现的实际问题（尤其是基质效应、色谱保留和常规操作方面的问题），该方法为临床实验室中的DPD表型分析提供了实用且标准化的分析方法。
化学物质和试剂
尿嘧啶（图1，左上）、二氢尿嘧啶（图1，右上）、尿嘧啶-d2（图1，左下）和二氢尿嘧啶-d4（图1，右下）购自加拿大多伦多研究化学品公司（Toronto Research Chemicals）。HPLC-MS级水、甲醇（MeOH）、异丙醇、乙酸和醋酸购自荷兰瓦尔肯斯瓦德（Valkenswaard）的Biosolve公司。
仪器
所有样品均使用Agilent 1290 Infinity LC系统（Agilent Technologies，美国帕洛阿尔托）配备6500 QTRAP?三重质谱仪进行分析。
色谱
最初评估了几种固定相对尿嘧啶、二氢尿嘧啶及其相应内标物的保留能力。无论是反相C18柱还是亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱，在调整流速和流动相组成后均无法实现有效的保留。进一步测试五氟苯基（PFP）和氰基（CN）柱在酸性和醋酸铵条件下的表现也不理想，样品峰在1分钟内即可洗脱。相比之下，PGC柱表现出良好的保留能力。
结论
总之，我们开发并验证了一种稳健的HPLC–MS/MS方法，用于同时定量人血浆中的尿嘧啶及其代谢物二氢尿嘧啶。该方法结合了样品提取、脂质去除和在PGC柱上的色谱分离，满足了国际验证要求。除了分析可靠性外，该方法还成功应用于实际临床血浆样本，并与外部方法进行了比较。
CRediT作者贡献声明
雅希亚·贝纳尼（Yahia Bennani）：撰写初稿、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。卡拉·切哈德（Carla Chehade）：撰写、审稿与编辑、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。卡罗琳·萨默（Caroline Samer）：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、概念构思。蒂博·科斯勒（Thibaud K?ssler）：撰写、审稿与编辑、概念构思。奥雷利安·托马斯（Aurélien Thomas）：撰写、审稿与编辑、验证、监督、方法学设计。尤瑟夫·达利（Youssef Daali）：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
