使用HPLC-荧光和LC-MS方法对COVID-19治疗患者血清和尿液中的巴瑞替尼（Baricitinib）和瑞德西韦（Remdesivir）进行高灵敏度双分析

《Journal of Chromatography B》：High-sensitivity dual analysis of Baricitinib and remdesivir in serum and urine using HPLC-fluorescence and LC-MS approaches in COVID-19 therapy

开发并验证了同时测定Baricitinib和Remdesivir的HPLC-荧光与LC-MS方法，适用于COVID-19治疗药物监测。HPLC-FLD灵敏度更高（LOQ 0.1-0.5 ng/mL），LC-MS线性范围更广（2000 ng/mL）。两种方法均通过准确度（96.41%-98.10%）和精密度验证，且HPLC-FLD环境友好性更优（AGREE 0.68 vs 0.56）。

　　

哈齐姆·M·阿里（Hazim M. Ali）| 拉蒂法·A·阿尔-卡提布（Lateefa A. Al-Khateeb）| 穆罕默德·M·戈尼姆（Mohammed M. Ghoneim）| 玛哈·M·阿卜杜勒拉赫曼（Maha M. Abdelrahman）| 伊斯梅尔·M·艾哈迈德（Ismail M. Ahmed）| 穆罕默德·加马尔（Mohammed Gamal）

沙特阿拉伯朱夫大学理学院化学系，邮政信箱2014，萨卡卡（Sakaka），阿尔朱夫（Aljouf）

摘要

为了支持巴瑞替尼（Baricitinib，简称BAR）和瑞德西韦（Remdesivir，简称REM）在COVID-19治疗中的联合使用，开发出敏感且准确的分析策略以同时定量这两种药物在生物流体中的含量至关重要。目前，尚无方法能够同时测定人体生物流体中这两种药物的浓度。为填补这一空白，我们开发、优化并验证了新的反相高效液相色谱-荧光（RP-HPLC-fluorescence）和液相色谱-质谱（LC-MS）方法，用于血清和尿液样本中BAR和REM的同时检测。高效液相色谱-荧光方法采用等度流动相（磷酸，pH=3；乙醇与水的比例为30:70，体积比v/v），流速为0.6 mL/min，检测波长为245/400 nm。此外，还开发了一种液相色谱-质谱方法，流动相为0.1%甲酸和0.05 M甲酸铵的水溶液与甲醇（体积比80:20，v/v），流速同样为0.5 mL/min。这两种液相色谱方法均得到了成功验证，并分别用于在5分钟和6分钟内同时分析添加了BAR和REM的混合样本。在人体生物样本中，HPLC-荧光方法的准确率在96.41%至98.10%之间，而LC-MS方法的准确率在95.17%至98.47%之间。HPLC-荧光方法的精密度范围为0.83%至1.23%，LC-MS方法的精密度范围为0.66%至1.55%。HPLC-FLD技术在微量水平下对BAR和REM的定量具有更高的灵敏度，其定量下限分别为0.1 ng/mL和0.5 ng/mL；而LC-MS方法的线性范围更广，BAR的线性范围可达2000 ng/mL，REM的线性范围可达1000 ng/mL。

使用“分析绿色度指标方法”（Analytical GREEnness Metric Approach，简称AGREE）进行的评估显示，由于HPLC-荧光方法使用了乙醇，其可持续性更强（AGREE得分为0.68），而LC-MS方法的可持续性较弱（AGREE得分为0.56）。这两种新方法的实际应用能力也得到了高水平的验证，其“蓝色适用性等级指数”（Blue Applicability Grade Index，简称BAGI）分别为77.5和75。在没有生物基质干扰的情况下，优化的LC方法表现出非常高的灵敏度和准确度。因此，这些方法非常适合用于BAR-REM组合的治疗药物监测和药代动力学研究。

引言

COVID-19是一种由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的传染病。该病毒于2019年12月首次在中国武汉被发现，随后迅速在全球范围内传播，引发了全球大流行[1]。美国食品药品监督管理局（FDA）在应对和管理该国COVID-19大流行方面发挥了关键作用，负责确保药品、疫苗、诊断工具和医疗设备的有效性和安全性[2]。截至2024年1月7日，世界卫生组织（WHO）报告的COVID-19病例总数已达774,075,242例。这凸显了通过疫苗接种和医疗干预来对抗这种广泛传播的病毒的必要性。

“绿色分析化学”（Green Analytical Chemistry）的理念侧重于在化学分析中采用可持续和环保的做法，以尽量减少对生态的影响，同时保持分析结果的精确性和有效性[3]。传统的分析方法经常使用有毒试剂、大量溶剂、高能耗，并产生大量废弃物。相比之下，绿色分析化学（GAC）提倡采用可持续、对环境友好的解决方案来解决这些问题[4]。

巴瑞替尼（BAR）是一种基于吡咯并嘧啶的化合物。经FDA批准，它可选择性地抑制Janus激酶1和2（JAK1和JAK2），被用于治疗类风湿性关节炎。它具有抗风湿、抗炎、免疫抑制和抗病毒作用[5]。然而，巴瑞替尼的免疫抑制特性可能会阻碍身体快速清除病毒感染的能力，从而增加继发感染的风险[6]。瑞德西韦（REM）是一种基于吡咯三嗪的化合物，是一种核苷类似物抗病毒药物，用于治疗RNA病毒感染，包括COVID-19[7]。在2020年5月1日获得FDA的紧急使用授权（Emergency Use Authorization，简称EUA）后，瑞德西韦于2020年10月22日正式被批准用于治疗COVID-19。它既可用于轻度至中度患者的门诊治疗，也可用于住院的成人及儿童患者[8]。

多项研究表明，巴瑞替尼与瑞德西韦联合使用比单独使用瑞德西韦效果更好，可加快患者的康复速度并改善临床状况，尤其是对于需要高流量氧气或非侵入性通气的患者[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。

2020年，美国食品药品监督管理局批准将巴瑞替尼与瑞德西韦联合使用。该药物被批准用于需要补充氧气、侵入性机械通气或体外膜氧合的住院成人及两岁及以上的儿童患者[14]。

一项针对住院COVID-19患者的临床研究表明，与仅使用瑞德西韦的患者相比，巴瑞替尼与瑞德西韦联合使用可缩短29天内的康复时间。巴瑞替尼治疗COVID-19的有效性和安全性仍在研究中，目前尚未被批准作为该疾病的单一治疗方法[15]。

高效液相色谱（HPLC）在分析生物流体中的药物方面发挥着重要作用，支持治疗药物监测、药代动力学研究、临床研究和法医调查。该技术能够精确测量药物浓度，评估药物的吸收、代谢和排泄情况，并追踪患者体内的药物水平，从而确保最佳剂量以增强治疗效果。结合荧光检测（HPLC-FLD）的HPLC技术特别适用于分析荧光化合物或在需要高分析灵敏度和特异性的情况下。液相色谱-质谱（LC-MS）依赖于HPLC仪器的分离效率和质谱检测器的特异性，能够在复杂的生物基质中实现所需的灵敏度和准确性。因此，LC-MS在药代动力学、治疗药物监测和法医毒理学等领域具有广泛的应用价值。

文献回顾显示，已有多种色谱方法用于测定巴瑞替尼的含量[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]；对于瑞德西韦，也采用了多种液相色谱方法进行分析[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。多项临床研究表明，瑞德西韦和巴瑞替尼对缓解COVID-19症状有效。然而，目前尚无同时测定这两种药物的技术。为解决这一问题，我们开发、优化并验证了新的RP-HPLC-fluorescence和LC-MS方法，用于生物流体（血清和尿液）中BAR和REM的同时检测。HPLC-FLD和LC-MS方法具有高灵敏度和选择性，适用于COVID-19患者的治疗药物监测和临床样本中的药物分析。

仪器

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  汉娜仪器（Hanna Instruments）生产的pH/ORP测量仪，以及Jenway 3040离子分析仪。
  为了使用HPLC-Fluorescence方法同时检测BAR和REM，我们使用了Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 UHPLC+标准系统，并配备了FLD-3000荧光检测器。数据采集和处理使用了Chromeleon? 7.2软件。
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  在LC-MS分析中使用的仪器

详细结果与讨论

临床药代动力学数据表明，多项研究量化了口服给药后BAR在生物流体中的最大血浆浓度（C_max）。报告的C_max值分别为24.6 ng/mL（2 mg剂量）、51.3 ng/mL（4 mg剂量）和152.0 ng/mL（10 mg剂量），显示出剂量依赖性的药代动力学特征[46]、[47]。相比之下，瑞德西韦在静脉注射（IV）给药后的最大血浆浓度（C_max）显著更高，为2270 ng/mL

结论

首次成功优化并验证了快速、环保且实用的高效液相色谱-荧光（HPLC-fluorescence）和液相色谱-质谱（LC-MS）技术，用于同时检测添加了BAR和REM的人体尿液和血清样本。这两种方法在灵敏度、线性、精密度和准确性方面表现优异。此外，这两种色谱方法已成功应用于同时评估添加了这两种药物的生物样本。

根据AGREE评价标准，

作者贡献声明

哈齐姆·M·阿里（Hazim M. Ali）：项目管理、方法学设计、数据分析、概念构建。 拉蒂法·A·阿尔-卡提布（Lateefa A. Al-Khateeb）：资源协调、实验设计、数据管理。 穆罕默德·M·戈尼姆（Mohammed M. Ghoneim）：监督工作、资源调配。 玛哈·M·阿卜杜勒拉赫曼（Maha M. Abdelrahman）：撰写与编辑、初稿撰写、监督工作、项目管理。 伊斯梅尔·M·艾哈迈德（Ismail M. Ahmed）：监督工作、资源协调。 穆罕默德·加马尔（Mohammed Gamal）：撰写与编辑、初稿撰写、项目管理、实验设计。

伦理批准声明

本研究遵循伦理研究标准，并获得了本尼苏夫大学药学院（Beni-Suef University）机构研究伦理委员会（REC-H-PhBSU-25,001）的正式批准。

资助

本研究由朱夫大学研究生院和科学研究部（Deanship of Graduate Studies and Scientific Research at Jouf University）资助，资助编号为（DGSSR-2025-02-01151）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

研究人员感谢朱夫大学研究生院和科学研究部提供的资金支持，使得本研究得以顺利进行（资助编号为（DGSSR-2025-02-01151）。