《Small》：Light-Guided Molecular Patterning for High-Throughput Single-Molecule Mechanical Characterization
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本文介绍了一种创新的光引导表面图案化方法，利用数字微镜器件（DMD）投影紫外（UV）图案，通过光交联核苷3-氰基乙烯基咔唑（CNVK）将寡核苷酸（oligos）共价固定在基底上，实现了单分子精度的可编程空间排列。该技术无需光刻设备，兼容磁镊（magnetic tweezers）和流体力谱（hydrodynamic force spectroscopy）等单分子力谱技术，能够构建六方和方形晶格等多种图案，并可顺序固定不同序列的分子，为高通量、多参数的单分子机械特性研究（如DNA解链力测量）提供了强大平台。其共价键合策略更能耐受高至880 pN的作用力，显著提升了实验的稳健性和应用范围。
光引导分子图案化用于高通量单分子机械表征
引言
在生物分子分析和功能材料设计领域，将单个生物分子精确地排列在表面上，达到单分子分辨率，具有巨大的潜力。单分子力谱技术通过施加机械力来探测纳米尺度的机械特性、分子相互作用和生物分子机制，已成为重要的研究工具。然而，传统的表面功能化方法往往缺乏足够的精确性、可编程性或可及性，导致生物分子排列随机或稀疏，限制了单分子技术，特别是多重单分子分析的通量和应用。为了解决这些问题，本研究开发了一种光引导的表面图案化方法。
结果与讨论
光引导分子图案化的原理
该方法的核心是利用光交联核苷3-氰基乙烯基咔唑（CNVK）的特性。首先，将带有DBCO-PEG13修饰的17核苷酸（nt）基础寡核苷酸通过无铜点击化学共价连接到叠氮化物功能化的盖玻片上。随后，加入可与基础寡核苷酸瞬时杂交的图案化寡核苷酸。该图案化寡核苷酸包含一个14 nt的杂交区域（内含一个CNVK核苷）和一个55 nt的功能区域，用于后续捕获DNA结构以连接微球。当通过数字微镜器件（DMD）投射的365 nm紫外光（UV）图案照射时，CNVK核苷会在几秒钟内与基础寡核苷酸中的胸腺嘧啶碱基发生交联，从而实现寡核苷酸的共价图案化。未暴露于UV光的瞬时杂交寡核苷酸则通过甲酰胺变性洗涤去除，确保最终图案与UV光照图案一致。
该方法的图案化分辨率，在考虑成像/照明系统的点扩散函数后，通过杂交荧光寡核苷酸并分析荧光强度，测得的高斯拟合半高全宽（FWHM）为992 nm。为实现序列可编程性，可以通过多次重复交联和洗涤过程，在流动池中依次图案化具有不同功能序列的寡核苷酸，从而为多重空间分辨的单分子力谱实验奠定基础。
可编程微球阵列的制备
在单分子力谱实验中，相邻微球之间的最佳距离至关重要，尤其是使用磁镊时，需要避免拴系微球之间的相互作用。本研究的光学方法能够“即时”生成任意图案，展示了高度的灵活性和精确的空间定位能力。研究人员成功制备了具有三种不同间距（11.5、15.3和19.2 μm）的六方和方形晶格微球阵列。每个图案的照明斑块尺寸设置为标称的780 nm × 780 nm正方形，足以拴系一个直径为2.8 μm的微球，并防止其他微球因空间位阻而拴系。
通过使用边缘检测算法测量微球中心的X和Y坐标，并分析相邻微球之间的距离和角度分布，结果显示实验测量值与设计值高度吻合。例如，六方晶格微球阵列的平均距离分别为11.5 ± 0.67, 15.37 ± 0.62, 和 19.07 ± 0.59 μm（平均值±标准差）；测得的角度也符合60°, 120°, 和~180°的预期。方形晶格阵列也表现出类似的高精度。此外，研究还演示了将微球排列成七段数码管形状的字母和数字，进一步证明了该方法在生成任意图案方面的强大能力。
多序列多重图案化
该方法的另一个显著优势是其高度的分子可编程性，能够空间组织具有不同身份的分子。通过重复图案化过程，可以将两种不同的分子物种精确地排列在表面上。首先，将具有序列1的图案化寡核苷酸通过UV光照排列成方形晶格。经过洗涤后，进行第二轮图案化：引入具有序列2的第二种图案化寡核苷酸，并使用一个相对于初始晶格单元中心偏移的UV图案进行交联。随后，将带有不同荧光染料的微球分别拴系到这两种不同的序列上。荧光成像结果显示，两种微球能够高效地、按序列特异性拴系到流动池表面预定的位置，清晰展示了该方法在精确定位多个不同分子靶标方面的能力。
图案化表面上的磁镊力谱
为了验证该方法在单分子力学研究中的应用，研究人员在图案化的流动池上进行了磁镊力谱实验。实验中使用了DNA纳米开关作为分子标尺，这是一种7.2 kb长的DNA构建体，在其长度上的不同位置连接了两个待研究的生物分子（此处为解链寡核苷酸）。当这两个分子结合时，构建体形成环状；当施加力导致键断裂时，构建体转变为线性状态，产生易于观察的长度增加。
研究人员设计了四种不同类型的DNA纳米开关，具有两种不同GC含量（48%和31%）的解链寡核苷酸序列和两种不同环大小（1.1和0.65 μm）。通过在图案化盖玻片上拴系磁珠并施加逐渐增大的磁力（最高至18.4 pN），观察到了清晰的解链（环打开）事件。通过严格的筛选标准（如拴系长度和环打开延伸量）来筛选单拴系磁珠，研究人员测量了不同序列的解链力。结果表明，对于GC含量为48%的构建体，平均解链力为12.9 ± 2.0 pN；对于GC含量为31%的构建体，平均解链力为12.0 ± 2.0 pN（平均值±标准差），显示出与GC含量相关的趋势，与先前在无镁条件下离心力显微镜（CFM）的测量结果趋势一致，尽管本研究中观察到的破裂力分布更宽，这主要归因于磁镊设置中力的异质性。同时，观察到的由于解链导致的DNA纳米开关延伸长度也与在12-13 pN力下双链DNA（dsDNA）拉伸的预期值吻合良好。
图案化表面上的流体力谱
为了证明该方法的普适性，研究人员还在图案化流动池上进行了基于流体力的单分子力谱实验。通过注射泵控制流速，对拴系的微球施加流体拖曳力。使用与磁镊实验相同的DNA纳米开关构建体，在较低的加载速率（约1.9 pN s-1）下测量解链力。结果显示，GC含量为31%和48%的寡核苷酸的平均解链力分别为约10.3 pN和11.0-11.4 pN。与磁镊实验结果相比，流体力谱测得的解链力较低，这与动态力谱原理一致，即较低的加载速率通常会降低最可能破裂力的值。不同环大小构建体的延伸长度测量结果也与预期相符。
用于高力应用的共价键微球图案化
非共价相互作用（如DNA杂交）在施加高力时容易断裂，限制了可施加的最大力。为了解决这一挑战，研究人员对图案化方法进行了改进，实现了微球的共价拴系。他们在图案化寡核苷酸的功能序列中引入了两个CNVK核苷，并使用带有叠氮化物的磁珠。微球通过寡核苷酸杂交排列到图案化表面后，对整个流动池进行UV照射，使珠子上的寡核苷酸与表面的图案化寡核苷酸通过CNVK发生共价交联。
通过比较共价拴系和非共价拴系表面在高流体力下的微球留存率，验证了共价策略的优越性。在非共价方法中，当施加每珠220 pN的拖曳力时，少于40%的拴系微球留存。相比之下，共价拴系的微球即使施加高达每珠880 pN的最大拖曳力，仍有98%的微球（n = 653）保留在原位，显著拓宽了力谱实验的力范围。
结论
本研究展示了一种光引导分子图案化方法，能够在不依赖昂贵光刻设备的情况下，精确排列具有多重身份的生物分子和微球。该方法具有高度的空间和分子可编程性、可及性和速度。通过与DNA纳米开关和磁镊、流体力谱等单分子技术结合，成功实现了多重单分子力谱测量，获得了与已知趋势一致的DNA解链力数据。独特的共价拴系策略使其能够耐受极高的作用力，并允许对同一分子进行重复测量，有助于更精确地解析分子异质性。与需要光刻掩模版或母模的现有方法相比，该技术仅通过操作DMD即可在几秒钟内生成任意分子图案，在生物物理学、纳米技术、分子诊断和先进表面工程等领域具有广泛的应用前景。
实验部分
研究详细描述了寡核苷酸和DNA纳米开关构建体的设计制备、流动池的制备、使用DMD进行寡核苷酸图案化、微球与图案化位点的连接、以及磁镊和流体力谱实验的具体步骤和条件。统计分析均基于明确的定量标准进行，确保了数据的可靠性。
