《Advanced Science》：Pan2-Pan3 Complex-Mediated Deadenylation Enforces mRNA Quality Control for Infection of the Rice Blast Fungus
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本综述揭示了稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中Pan2-Pan3去腺苷化酶复合物通过调控mRNA多聚腺苷酸（poly(A)）尾长度，在病原菌侵染过程中发挥关键作用。该复合物定位于P小体（P-bodies），通过精确控制自噬（autophagy）、内质网质量监控（ERQC）和活性氧（ROS）解毒相关基因（如ATG5、GLS2、DES1）的mRNA稳定性，协调附着胞（appressorium）成熟和宿主穿透。研究为作物保护提供了新型靶点。
1 引言
mRNA从产生到降解的旅程中，可逆修饰决定其翻译效率。真核生物mRNA 3'端的非模板多聚腺苷酸（poly(A)）尾既是保护罩也是计时器：初始长度保护mRNA免遭外切酶降解并促进翻译，而去腺苷化酶（deadenylases）介导的逐步缩短最终导致mRNA沉默。两个保守复合物——Ccr4-Not和Pan2-Pan3——执行这一时序程序，但它们在真菌病原体中的生物学意义尚不明确。
稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究这一假设的理想模型。作为全球最具破坏性的病原菌之一，其成功侵染依赖于时间关键决策：在接触叶片数小时内，真菌必须将表面疏水性和营养匮乏信号转化为黑色化附着胞，产生巨大膨压穿透宿主角质层。该结构形成伴随整体代谢重塑：糖原和脂质储备动员、自噬触发、活性氧解毒以及效应因子分泌。这些过程由基因表达波驱动，其时机需要精确协调，而执行这种协调的转录后机制未知。
2 结果
2.1 稻瘟病菌中Pan复合物的鉴定
通过NCBI数据库搜索，鉴定出稻瘟病菌中Pan2（MGG_17449）和Pan3（MGG_02939）两个亚基。系统发育分析显示两者在植物病原真菌中高度保守。Pan2蛋白含N端WD40重复样结构域、泛素C端水解酶（UCH）结构域和C端RNase H样基序；Pan3蛋白预测含CCCH型锌指结构域、蛋白激酶样基序和C端假激酶结构域。AlphaFold结构预测表明两者可能形成复合物，酵母双杂交和免疫共沉淀实验证实Pan2与Pan3存在相互作用。亚细胞共定位显示Pan2-RFP和Pan3-GFP在菌丝、分生孢子、附着胞和侵染菌丝中共定位。发育阶段表达分析表明PAN2和PAN3在营养菌丝、分生孢子、芽管中表达较高，且在侵染过程中（IH18H至IH48H）表达逐步增加。体外去腺苷化实验证实Pan2-Pan3复合物具有降解90A mRNA的活性。
2.2 Pan2-Pan3复合物对无性发育和形态发生至关重要
通过split-PCR策略构建PAN2和PAN3单敲除（Δpan2、Δpan3）及双敲除（Δpan2Δpan3）突变体。在燕麦番茄琼脂（OTA）上培养5天后，突变体菌落直径显著小于野生型（WT）和回补菌株。钙白荧光染色显示突变体菌丝细胞长度显著短于WT。分生孢子产量观察发现突变体产孢量显著高于WT。胁迫敏感性实验表明，突变体对细胞壁完整性扰动剂（CFW、CR、SDS）和渗透胁迫剂（NaCl）更敏感，而对山梨醇胁迫的抑制率低于WT。
2.3 Pan2-Pan3复合物协调稻瘟病菌致病性
大麦和水稻喷雾接种实验显示，Δpan2和Δpan3突变体病斑数量少且面积小，双敲除突变体病斑扩展严重受限。水稻鞘侵染过程观察发现，24 hpi时突变体附着胞发育为侵染菌丝的比例显著低于WT；36 hpi时突变体分枝侵染菌丝比例仍明显较低。大麦表皮侵染实验获得一致结果，表明PAN2和PAN3是侵染生长所必需的。
2.4 Pan2-Pan3缺失损害附着胞成熟
附着胞形成率分析显示，6 hpi和12 hpi时突变体形成率显著低于WT，但24 hpi时无显著差异。甘油渗透压实验表明，突变体附着胞崩溃比例显著高于WT，且双敲除突变体崩溃比例最高。糖原和脂质染色显示，12 hpi和18 hpi时突变体附着胞中糖原和脂质滞留量显著高于WT，表明代谢物利用受阻。
2.5 Pan2-Pan3缺失导致自噬缺陷
氮饥饿诱导实验显示，WT中GFP-Atg8标记的自噬体在液泡内比例随时间增加（2 h达40%，5 h达85%），而突变体比例显著降低（Δpan2Δpan3仅20%）。Western blot检测自噬流（GFP/[GFP+GFP-Atg8]比值）证实突变体自噬活性降低。附着胞发育过程中自噬体观察发现，突变体自噬信号显著减少，表明Pan复合物对自噬体形成至关重要。
2.6 P小体形成依赖Pan2-Pan3活性
共定位实验证实Pan2-RFP和Pan3-GFP与P小体标记蛋白Lsm14-GFP共定位。P小体数量统计显示，突变体中点状荧光信号稀疏，双敲除突变体几乎无信号。环己酰亚胺（分散P小体）和嘌呤霉素（促进P小体组装）处理实验进一步证实Pan复合物调控P小体生物发生。
2.7 Pan2-Pan3复合物调控稻瘟病菌mRNA去腺苷化
poly(A)-seq分析显示，Δpan2Δpan3中mRNA的poly(A)尾长度分布整体右移，平均长度长于WT。筛选标准（p ≤ 0.05且Δpoly(A)长度≥5 nt）鉴定出1551个基因在突变体中poly(A)尾显著延长。GO和KEGG富集分析显示这些基因主要参与RNA相关生物学过程和核糖体通路。
2.8 Pan2-Pan3复合物参与RNA相关过程并调控致病相关基因表达
RNA-seq分析发现Δpan2Δpan3中1954个基因显著上调，1369个基因下调。GO和KEGG富集表明上调基因富集于RNA代谢、核糖体复合物生物发生等通路。整合分析鉴定出390个同时具有poly(A)尾延长和表达上调的基因，其中43个为已报道基因，18个为致病相关基因（如ATG5、UBC9、TDG4、DES1、GLS2等）。
2.9 Pan2-Pan3复合物调控三个关键mRNA的去腺苷化
选取ATG5（自噬）、GLS2（ERQC）、DES1（ROS解毒）进行深入分析。密度图和提琴图证实突变体中三者poly(A)尾长度显著增加。PCR-based poly(A)长度检测验证了这一结果。放线菌素D追踪实验显示，突变体中这三个mRNA的半衰期显著短于WT。Western blot检测发现突变体中Atg5、Gls2、Des1蛋白水平显著降低，表明Pan复合物通过调控poly(A)尾长度影响mRNA稳定性和蛋白输出。
3 讨论
本研究将Pan2-Pan3去腺苷化酶复合物定位为稻瘟病菌致病性的核心调控节点，揭示mRNA降解是真菌致病性的主动建构者而非被动结果。Pan2-Pan3介导的poly(A)尾缩短通过协调代谢重编程、自噬和宿主穿透，成为发育时序与毒性执行的关键枢纽。研究发现Pan2和Pan3定位于P小体并调控其生物发生，将无膜细胞器的功能从mRNA存储扩展至发育命运的主动塑造。从应用角度，Pan2-Pan3作为病原菌特有靶点，为作物保护提供了新型策略。该研究不仅深化了对RNA代谢调控致病性的理解，也为针对RNA衰减而非蛋白功能的可持续作物保护策略奠定基础。
4 实验方法
实验采用稻瘟病菌野生型菌株P131，在燕麦番茄琼脂（OTA）上28°C培养。基因敲除利用split-PCR策略，通过潮霉素（HPT）和新霉素（NEO）抗性筛选突变体。表型分析包括菌落生长、分生孢子产量、胁迫敏感性、附着胞形成和成熟度检测。致病性测试通过喷雾接种大麦和水稻幼苗，观察病斑发展。自噬分析采用GFP-Atg8标记和Western blot。P小体观察通过Lsm14-GFP标记及化学处理（环己酰亚胺、嘌呤霉素）。分子生物学实验包括RT-qPCR、酵母双杂交、免疫共沉淀、体外去腺苷化活性检测。组学分析涉及RNA-seq和poly(A)-seq文库构建、测序及生物信息学处理。数据统计采用GraphPad Prism进行单因素方差分析和Dunnett's检验。
