《Advanced Science》：Alkaline Phosphatase-Activated NIR-II AIEgens Nanosystem for Surgical and Postoperative Closed-Loop Therapy of Advanced Osteosarcoma
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本文报道了一种碱性磷酸酶（ALP）响应的诊疗一体化纳米平台（SGPF），该平台通过整合具有聚集诱导发光（AIE）特性的NIR-II（第二近红外窗口）荧光团（STEA）和热休克蛋白90（HSP90）抑制剂Ganetespib，实现了对晚期骨肉瘤（OS）的成像引导手术切除、光热/光动力（PTT/PDT）治疗以及术后免疫微环境重塑的协同治疗。该策略针对骨肉瘤免疫抑制微环境（TME）的缺氧、酸中毒等关键病理特征，通过ALP触发药物释放、缓解缺氧、抑制糖酵解并诱导细胞焦亡（pyroptosis），从而将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，激活系统性抗肿瘤免疫，为不可切除的晚期骨肉瘤提供了闭环治疗新范式。
1 引言
骨肉瘤（OS）是一种高度侵袭性的原发性恶性骨肿瘤。尽管手术、放疗、化疗和靶向治疗取得了进展，但患者的5年生存率仍未显著提高。对于肿瘤侵犯关键神经血管结构的晚期骨肉瘤患者，完全切除常因术中大出血、死亡或肢体功能受损的风险而无法实现，残留病灶成为术后复发和转移的主要风险源。肿瘤免疫疗法的出现为晚期骨肉瘤患者带来了新希望，但部分患者因肿瘤微环境（TME）的复杂性和治疗耐药性而对免疫治疗反应不佳。其中，局部肿瘤酸中毒和缺氧、免疫抑制细胞浸润以及肿瘤代谢重编程是导致免疫治疗效果不佳的关键因素。因此，迫切需要能够实现多靶点、多模式协同作用的替代治疗策略，以克服晚期骨肉瘤免疫治疗的当前局限。
晚期骨肉瘤的TME充满交织的病理线索。广泛的骨矿化压实细胞外基质并压迫瘤内血管，导致灌注不足和慢性缺氧。缺氧应激激活HIF-1α，进而上调VEGF和PD-L1，加剧血管功能障碍并阻碍淋巴细胞浸润。同时，肿瘤细胞高度依赖有氧糖酵解，导致乳酸大量产生，使微环境pH值降至6.5以下；这种酸中毒损害树突状细胞（DC）成熟，并有利于M2极化巨噬细胞和调节性T细胞（Treg）的募集，从而放大免疫抑制。尽管坏死碎片和骨片段释放的危险相关分子模式（DAMP）可能增强适应性免疫，但其抗原潜力被浪费：过度活跃的HSP90和失调的抗原加工机制阻碍了有效的交叉呈递。 collectively，这些结构、代谢和信号异常使骨肉瘤成为典型的“冷”肿瘤，对当代免疫疗法反应不佳。
值得注意的是，基于纳米材料的光热和光动力疗法（PTT和PDT）可通过局部物理化学反应直接产生细胞毒性，并诱导免疫原性细胞死亡（ICD），释放大量DAMP和肿瘤相关抗原（TAA）。这种抗原释放的激增显著增强了抗原呈递，加速了树突状细胞成熟，并促进了T细胞浸润，为将冷肿瘤转化为免疫学上的“热”肿瘤提供了一条独特的途径。然而，仅靠扩增的抗原暴露无法克服TME中普遍存在的乳酸驱动的酸中毒。因此，只有将PTT/PDT触发的免疫原性死亡与肿瘤复氧、pH正常化和糖酵解阻断相结合，才能系统性地解除多层次的免疫抑制屏障，并将微环境重新极化向免疫激活，从而增强治疗效果。
与旨在提高治疗特异性的抗体修饰和配体介导的靶向等当前策略相比，基于TME特性合理设计的刺激响应性纳米材料可以在病理部位被选择性激活，从而增加局部药物积累和抗原暴露。这些系统具有结构简单、组织穿透能力强和全身毒性低等优点，特别适用于晚期骨肉瘤的治疗。
聚集诱导发光材料（AIEgens）被认为是诊疗平台的理想候选者，因为它们在聚集状态下荧光稳定，并且具有可调节的能量耗散途径用于光疗。AIE分子的设计通常包含多个可自由旋转的芳香转子，在分子分散状态下，通过剧烈的分子内运动将激发态能量以热的形式耗散。 upon tight aggregation，分子骨架采取扭曲构象，抑制了不希望的分子间弛豫，从而增强荧光强度并促进系间窜越（ISC）。为了将吸收和发射红移至第二近红外窗口（NIR-II），大多数AIEgens通过扩展给体-受体单元之间的π共轭骨架或引入重原子来缩小HOMO-LUMO能隙；这两种策略同时放大了PTT和PDT效应。此外，增强分子内电荷转移（ICT）效应可以促进激发态电子转移，产生I型活性氧（ROS），包括超氧阴离子（O2?）和羟基自由基（·OH）。与依赖能量转移的II型ROS（单线态氧，1O2）不同，I型ROS通过电子转移直接氧化生物分子。它们的产生对缺氧微环境不太敏感，并且具有更大的有效作用半径，能够扩散到远端细胞，克服光敏剂分布异质性的限制。至关重要的是，它们可以与细胞焦亡过程中释放的肿瘤相关抗原（TAA）协同作用，激活系统性免疫反应。
2 材料与方法
本研究构建了一个基于NIR-II AIEgen的诊疗纳米平台。将AIE分子STEA和HSP90抑制剂Ganetespib共包裹在基于聚磷酸酯的胶束中，随后将全氟己烷（PFH）负载到胶束核心，形成纳米复合材料SGPF。在808 nm激发下，STEA的荧光延伸至NIR-IIb区域，实现精确的肿瘤定位。值得注意的是，硒的掺入显著缩小了STEA的HOMO-LUMO能隙，赋予SGPF优异的光热和光动力治疗功效。当到达具有高碱性磷酸酶（ALP）表达的肿瘤部位时，SGPF经历渐进的酶降解，导致载荷释放。释放的STEA分子可以聚集并在1064 nm光激发下产生增强的光疗效果，诱导细胞焦亡和ICD，同时使PFH汽化，产生持续氧气释放以缓解肿瘤缺氧。同时，释放的Ganetespib抑制肿瘤糖酵解的关键酶，从而减少局部乳酸积累。这种有利于免疫的微环境促进了免疫效应细胞的强劲浸润，有效地将免疫学上的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。由此产生的系统性抗肿瘤免疫反应也靶向转移灶，显著降低了远处转移的发生率。因此，本研究提出了一种“闭环”诊疗策略，将术中成像引导切除、即时光疗消融残留肿瘤以及通过代谢重编程实现的术后持续免疫治疗整合在一起。
3 结果与讨论
3.1 合成与表征
在强给体-受体-给体（D-A-D）结构上扩展π共轭框架是开发具有长波长吸收和发射荧光团的有效策略。然而，扩展π桥的引入通常会增加分子疏水性，这使分子易于发生紧密的π-π堆积，从而通过非辐射衰变途径促进能量耗散。为了解决这个问题，通过共价连接三个关键组分设计了染料分子STEA：甲氧基取代的四苯基乙烯-三苯胺（TPE-TPA）作为外围给体单元，具有空间位阻的联噻吩作为π桥和主要电子给体，以及硒取代的苯并双噻二唑（SBTD）作为中心强电子受体。TPE-TPA的螺旋桨状构象由于空间位阻提供了扭曲的分子几何形状，赋予其聚集诱导发射（AIE）特性。此外，其丰富的自由转子增强了非辐射热运动。重原子SBTD的掺入加强了D-A相互作用，这不仅减小了能隙，而且促进了系间窜越（ISC）过程。STEA的合成通过1H NMR、13C NMR谱和质谱得到确认。
STEA表现出从700 nm到1200 nm的宽近红外吸收谱，在972 nm处有一个明显的吸收峰。值得注意的是，其大部分吸收位于NIR-II窗口内，使其适用于后续使用NIR-II激光照射的光疗。在808 nm激发下，STEA发射荧光，最大发射波长为1266 nm，相对量子产率为0.75%，发射范围延伸至1700 nm，进入NIR-IIb区域，有利于高分辨率的术前光学成像。进一步计算显示，其HOMO-LUMO能隙窄至1.17 eV。这种减小的能隙主要归因于含硒受体的强吸电子性质，这也解释了STEA的红移吸收和发射特性。为了研究其AIE特性，使用不同比例的DMSO和异丙醇混合物诱导STEA聚集。随着异丙醇比例的增加，荧光强度逐渐增强，在60%异丙醇时达到最大值，表现出显著的AIE行为。在80%异丙醇时强度略有下降，这可能是由于在不良溶解条件下大的STEA聚集体沉淀所致。
碱性磷酸酶（ALP）是骨肉瘤检测和监测的临床公认生物标志物，其在患者中的表达水平通常是正常组织的100-317倍。与肿瘤微环境的其他常见特征（如缺氧、酸性或谷氨酰胺依赖）相比，ALP表现出更高的稳定性和更清晰的定位，主要分布在细胞膜和细胞外空间。这些特性使ALP成为响应性药物递送系统更合适和可及的触发因子。基于此，合成了一种含有丰富磷酸酯单元的两亲性三嵌段聚合物（PEEP-PCL-PEEP，简称PEEP），并用于构建胶束，该胶束可在高ALP活性的肿瘤区域降解以释放载荷。通过将染料STEA和HSP90抑制剂Ganetespib包裹在PEEP基质中形成胶束，然后使用脂质体挤出器反复挤压PFH将其加载到胶束中，生成名为SGPF的纳米平台。透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和能量色散X射线光谱（EDS）证实了所有三种组分的成功封装。与溶液中溶解的染料相比，胶束的吸收和发射光谱均显示红移，发射峰接近1400 nm。使用不同厚度的鸡胸肉模拟组织穿透深度，荧光强度随着组织厚度的增加而逐渐降低，在深度达10 mm处仍可检测到信号。
3.2 PTT和PDT评估
SGPF的光热转换行为如图所示。在1064 nm激光照射（功率密度1 W cm?2）下，胶束溶液的温度在1分钟内迅速升高，这主要归因于扭曲的分子构象和丰富的分子内转子。照射5分钟后，所有测试浓度的胶束温度达到稳定状态，在浓度为15和20 μM时，最高温度分别达到53.5°C和60°C。在固定浓度15 μM下，进一步评估了不同功率密度下的温升，当激光功率为1.4 W cm?2时，温度平台超过62°C。最终温度与材料浓度或激光功率密度呈正相关。值得注意的是，当温度超过45°C时，观察到可见的气泡形成，表明PFH逐渐汽化。在重复的加热-冷却循环中，SGPF的最高温度几乎保持不变，证实了其优异的光热稳定性。SGPF的光热转换效率计算为47.7%，高于大多数先前报道的NIR-II光热剂。分子动力学模拟用于研究STEA在水介质中聚集时的构象变化。在聚集体内部，观察到给体-受体二面角为42°和52°，分子内旋转促进了从局部激发态到扭曲分子内电荷转移（TICT）态的转变。由于其对各种非辐射衰变过程的敏感性，该系统表现出大大增强的光热性能。
随后在1064 nm激光照射（功率密度1 W cm?2）下评估了光动力性能。在25分钟激发内未观察到ABDA的显著降解，表明单线态氧的产生可忽略不计。计算出的STEA的单线态（S1）和三线态（T1）能量分别为0.96和0.388 eV。重要的是，T1能级（0.388 eV）不足以敏化3O2生成1O2（0.97 eV），这解释了许多NIR-II荧光团缺乏单线态氧产生的原因。使用二氢罗丹明123（DHR123）和亚甲蓝作为特异性探针，证实了SGPF产生超氧阴离子（•O2?）和羟基自由基（•OH）的能力，表明该系统具有有效的光动力活性。值得注意的是，与在相同照射条件下的商业化光敏剂二氢卟酚e6（Ce6）相比，STEA表现出更优的ROS产生能力，进一步凸显了其作为高效光动力剂的优势。类似的观察结果也在其他涉及NIR-II AIEgens的研究中报道过，超氧阴离子的产生可能有助于后续的免疫激活。
3.3 ALP响应性降解增强SGPF功能性
系统检查了胶束响应ALP的动态行为。在酶刺激下，亲水聚合物链中的磷酸酯键被逐步切割，导致内部疏水片段逐渐暴露。这些暴露的疏水组分随后在模拟血流的剪切条件下倾向于自组装成更大的簇。这种结构转变通过FTIR分析得到证实，该分析跟踪了疏水核心中酯基和亲水壳中磷酸酯键之间比率的变化，确认了亲水域的逐步切割。DLS分析显示，经过24小时ALP处理，胶束尺寸持续增加。具体而言，平均粒径在6小时时增加了一倍以上，并在24小时后相对于初始状态增加了三倍。但SGPF在PBS和DMEM培养基中7天内表现出良好的稳定性。这证明了纳米复合物在到达靶点之前具有稳健的稳定性，这是实现有效全身递送和后续酶激活的前提。同时，在整个转化过程中监测到氧气释放增加。这种聚集行为与封装分子的AIE特性非常吻合，因为长时间的ALP暴露导致荧光强度稳定增强，这有利于肿瘤切除过程中的术中荧光引导。为了保持荧光和非辐射弛豫之间的平衡，评估了不同的封装比例。虽然更高的STEA负载增强了光热和光动力效应，但过度负载导致荧光强度略有降低。因此，选择25 nmol的负载量，以在酶诱导聚集后保持足够的荧光，同时保留治疗效果。
同时，评估了胶束在降解过程中光热和光动力效应的变化。在ALP孵育后，激光照射下观察到温度逐渐升高。酶反应6小时后，温度升高了4.3°C，24小时后进一步升高了6.8°C。光动力性能在降解的前2小时内基本保持不变。鉴于I型ROS的产生主要依赖于电子转移而非氧气可用性，其光动力效应可以在缺氧肿瘤微环境中实现更广泛的细胞毒性覆盖。此外，研究了Ganetespib从SGPF胶束在不同条件下的释放行为，包括ALP存在、pH和温度。在中性pH且无酶活性条件下，释放量极少，24小时后仅释放11%。相比之下，ALP显著加速了药物释放，3小时达到52%，24小时达到83.5%。酸性环境主要影响早期释放行为，导致早期释放适度加速。随着释放的进行，ALP介导的磷酸酯键切割成为主导机制，导致在不同pH条件下后期释放曲线相似。此外，模拟肿瘤微环境的高温显著增强了药物释放。在高温组中，1小时的释放速率是非加热对照组的1.3倍，24小时累积释放达到96.6%。 collectively，这些结果表明，ALP响应性胶束系统不仅能够实现药物释放的时空控制，而且在光热辅助化疗方面提供了协同优势。
3.4 细胞毒性测定评估SGPF的治疗效率
SGPF纳米颗粒在体外表现出强大的光热、光动力和酶激活药物释放能力。随后，系统评估了其在细胞水平上的肿瘤杀伤功效。为了阐明载药胶束的抗肿瘤效果，将不含药物的胶束指定为AIE NPs。在细胞水平上进一步验证了SGPF的酶响应性和选择性。使用高ALP骨肉瘤细胞和低ALP对照细胞的比较研究揭示了SGPF处理的显著差异。与低ALP细胞相比，与SGPF共孵育后，LM8细胞表现出明显更亮的细胞内NIR荧光。这种AIEgen摄取和聚集的对比与细胞的差异ALP表达谱直接相关，为SGPF的解体及其有效载荷的释放是由ALP活性选择性触发的提供了有力证据。该结果证实了我们的纳米平台激活机制具有预期的疾病部位特异性。NIR共聚焦成像显示，SGPF与OS细胞共培养2小时内，AIE分子快速内化。SGPF纳米平台的内化是一个顺序过程，由细胞外ALP触发的降解启动，这通过高ALP LM8细胞中细胞内AIE荧光的选择性和时间依赖性增加得到证明。单独NIR照射对细胞活力没有显著影响。进一步评估了AIE NPs和SGPF对LM8细胞的影响，无论有无NIR照射，结果表明AIE NPs表现出良好的生物相容性，细胞毒性最小，而SGPF显示出强大的肿瘤杀伤效果。这种功效与HSP90抑制剂机制相关。作为分子伴侣，HSP90稳定驱动多种恶性肿瘤进展的客户蛋白。先前研究证实，HSP90抑制通过促进凋亡和细胞周期阻滞诱导OS细胞死亡。特别是，当纳米颗粒浓度超过0.01 μM时，1064 nm NIR照射显著增强了肿瘤消融效果，其功效表现出浓度依赖性放大，与PTT/PDT机制一致。
为了进一步阐明SGPF纳米平台中各治疗组分的个体贡献，进行了额外的体外细胞毒性试验，比较了完整制剂与选择性缺少Ganetespib或PFH组分的纳米颗粒，无论有无NIR照射。这些实验证实了各元素在我们组合设计中的独特和互补作用。结果证实，光疗细胞杀伤效应与AIEgen的存在本质相关，表现出明显的浓度依赖性功效。值得注意的是，不含PFH的纳米颗粒表现出与完整SGPF几乎相同的细胞毒性谱，强调了PFH已充分证明的生物相容性和缺乏固有细胞毒性。这一发现与其作为惰性氧气载体的设计主要功能一致，旨在缓解肿瘤缺氧和调节免疫微环境，而非发挥直接细胞毒作用。相反，不含Ganetespib但含有PFH的纳米颗粒与SGPF相比显示出显著降低的细胞毒性，突出了HSP90抑制剂作为强效药理细胞杀伤效应主要来源的作用。这与其作为破坏致癌蛋白稳态的抗肿瘤剂的既定作用一致。在我们SGPF平台的背景下，Ganetespib的细胞毒性是治疗策略的一个关键且预期的方面，它与光疗协同作用，不仅消除肿瘤细胞，而且促进向免疫原性细胞死亡的转变，从而作为整体治疗范式中免疫致敏的关键驱动因素。
进行PI/Calcein-AM活死染色以检查治疗诱导的细胞死亡程度。虽然单独的HSP90抑制引发了部分细胞死亡，但NIR照射显著增强了SGPF处理细胞的致死率。明场显微镜揭示了联合SGPF/NIR处理下LM8细胞中出现细胞焦亡形态：细胞肿胀和膜破裂——这是gasdermin介导的细胞焦亡的标志。这与光热/光动力疗法诱导线粒体ROS介导的gasdermin家族蛋白激活的报道一致。关键的是，细胞焦亡代表了一种不同于凋亡的促炎性细胞死亡方式。其在肿瘤中的诱导可能通过重塑肿瘤微环境来增强免疫检查点抑制剂的疗效。这种机制不仅解决了治疗耐药性，而且为免疫激活和癌症疫苗开发提供了新的视角。
3.5 光疗和SGPF在体外协同诱导Caspase3/GSDME介导的细胞焦亡
使用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）定量分析了由•O2?和•OH产生导致的高水平细胞内ROS。单独SGPF处理观察到最小的ROS诱导，而1064 nm NIR照射后发生显著的ROS放大，证实了有效的光动力激活。先前的证据表明，温和的光热和HSP90抑制都会加剧线粒体损伤，破坏氧化还原稳态。JC-1染色显示，SGPF+NIR组中线粒体膜电位显著消散。这种由电子传递链质子泵维持的电化学梯度控制着ATP合成和ROS调节。其崩溃触发线粒体外膜透化，促进细胞色素c释放和caspase级联启动。明场显微镜在SGPF处理的样品中识别出异质性细胞死亡形态。大多数细胞表现出经典的凋亡特征，包括细胞皱缩、胞质浓缩和细胞器压缩，而少数表现出细胞焦亡特征。NIR照射显著增加了细胞焦亡细胞的普遍性，SGPF+NIR组的细胞焦亡发生率显著高于AIE NPs+NIR组。蛋白质印迹分析证实了SGPF介导的光疗中caspase-3激活和gasdermin E切割，这通过积累的执行细胞焦亡孔形成的N端GSDME片段证明。虽然HSP90抑制剂通常促进凋亡，但我们的光疗系统将细胞死亡转向细胞焦亡。这种转变机制上可归因于caspase通路的汇聚：HSP90抑制放大了caspase活性，在占主导地位的PDT/PTT诱导的细胞焦亡信号下，优先切割GSDME而不是激活凋亡效应子。总之，我们提出，向细胞焦亡的转变是由高信号、促炎性细胞环境的协同创造驱动的。强烈的光疗产生的ROS导致深刻的线粒体损伤，触发强大的caspase-3激活，超过了常规凋亡的阈值。同时，HSP90抑制可能通过调节细胞状态发挥允许作用，可能影响死亡底物的稳定性。在这种以 elevated caspase-3活性和炎症信号为特征的特定环境中，GSDME被有效切割。产生的N端片段寡聚化形成质膜孔，从而执行观察到的免疫原性细胞焦亡结果。乳酸脱氢酶释放测定为细胞焦亡提供了功能验证，因为gasdermin介导的孔形成过程中的质膜破裂允许胞质LDH外流。细胞焦亡是一种免疫原性细胞死亡方式，以释放TAA和DAMP为特征。虽然细胞焦亡诱导增强了热疗诱导的细胞毒性，但其增强免疫治疗疗效的能力仍然受到TME内免疫抑制屏障的限制。因此，需要进一步验证SGPF纳米颗粒是否可以通过TME重塑来克服这些微环境限制，从而激活系统性抗肿瘤免疫。
3.6 体外靶向肿瘤细胞有氧糖酵解伴随免疫激活的调节
肿瘤微环境中乳酸的积累，由有氧糖酵解驱动，有效地促进肿瘤生长和转移。这种代谢重编程为增殖提供能量和生物合成前体，同时建立酸性环境，诱导上皮-间质转化和血管生成，从而增强侵袭性。同时，乳酸通过抑制CD8+T/NK细胞毒性和IFN-γ分泌，损害树突状细胞成熟，并扩增免疫抑制群体，将TME重塑为免疫抑制生态位。这种代谢重编程通过T细胞耗竭和乳酸诱导的赖氨酸乳酸化直接损害免疫检查点阻断疗效。Chen等人最初证明，通过ganetespib抑制HSP90通过双靶向PKM2/PFKP抑制糖酵解，从而减轻IL-8介导的免疫抑制并增强头颈癌的放疗疗效。在本研究中，蛋白质印迹分析证实ganetespib同样下调OS中PKM2、HK2和LDHA的表达。Seahorse代谢测定进一步显示，SGPF纳米颗粒显著抑制了LM8细胞的有氧糖酵解。细胞外酸化率和耗氧率的同时降低表明线粒体功能和能量代谢受到深刻损害。值得注意的是，温和的光热效应不同于消融性热疗，会加速肿瘤代谢并矛盾地加剧乳酸产生。当LM8细胞经受43°C时，观察到糖酵解限速酶和HSP90的表达升高。然而，SGPF处理抵消了这种热适应，即使在高温条件下也抑制了HSP90和代谢酶。关键的是，SGPF联合NIR照射协同降低了上清液中的乳酸积累，表明有效的代谢重编程。对保持在37°C或43°C的LM8细胞进行了全赖氨酸乳酸化的蛋白质印迹分析，并在37°C下用SGPF、AIE NPs加NIR或SGPF加NIR处理。在升高温度下观察到细胞内蛋白质的全赖氨酸乳酸化增加，而这种修饰通过SGPF+NIR联合处理有效逆转，这是通过减弱乳酸积累实现的。先前的研究已经确定，乳酸积累诱导的多种蛋白质的赖氨酸乳酸化促进了肿瘤的恶性表型，包括加速进展和免疫治疗耐药。
为了评估乳酸减少的免疫学后果，建立了一个transwell共培养系统。SGPF处理的肿瘤细胞促进了未成熟DC的成熟，NIR照射后效果增强。这种效应归因于三种互补机制：PDT/PTT介导的免疫原性细胞死亡释放肿瘤抗原；细胞焦亡触发的抗原呈递细胞激活；乳酸消耗减轻DC功能抑制。类似地，SGPF+NIR处理将巨噬细胞极化为抗肿瘤表型，这通过M2标记物减少证明。鉴于M2巨噬细胞分泌IL-10/TGF-β并表达PD-L1以抑制CD8+T细胞和招募Treg，它们的复极化标志着TME重塑。 collectively，SGPF介导的光疗实现了代谢重编程，抑制乳酸分泌，与细胞焦亡诱导的免疫原性协同作用，并促进DC成熟，同时抑制M2巨噬细胞极化。这种多方面的策略为增强ICB疗效奠定了基础。
SGPF与近红外照射的联合治疗方案引起了糖酵解代谢的深刻重编程，这通过关键途径中间体的明显改变证明。比较分析显示，治疗组中多种糖酵解代谢物相对于对照组显著下调，乳酸表现出特别明显的抑制。值得注意的是，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸水平显著降低，表明糖酵解末期的代谢通量减少或丙酮酸向辅助生物合成途径的转移增强。这些观察结果得到代谢物集富集分析的进一步证实，该分析确定糖酵解在实验组之间表现出显著高的富集倍数，共同表明治疗诱导了糖酵解通量的实质性扰动和潜在的代谢重连。
转录组分析产生了互补的见解，火山图分析揭示了实验组和对照组之间广泛的差异基因表达。随后对糖酵解相关基因的检查证明了一致的转录变化，尽管mRNA和蛋白质表达模式之间存在有趣的分离。虽然HK2和PKM2转录本没有观察到显著上调，但它们的蛋白质水平显著降低——这一现象可能归因于HSP90抑制剂主要调节这些关键糖酵解酶的翻译后稳定性，而不是影响它们的转录调控。相反，PKM1表达被发现下调，可能有助于观察到的下游代谢物减少，包括丙酮酸。这些发现共同表明，SGPF加NIR治疗策略可能通过规范和非规范调控机制发挥其对肿瘤细胞有氧糖酵解的抑制作用。
通路富集分析确定了几个具有特别高富集分数的信号级联，包括Wnt、Notch和MAPK通路——所有这些在先前的研究中都被广泛记录为糖酵解激活和肿瘤细胞代谢重编程的关键调节因子。这些通路的协调调节提供了令人信服的证据，表明SGPF加NIR干预引起了肿瘤细胞恶性表型的多方面抑制，同时靶向其增殖能力和代谢适应性。这些全面的发现为支持后续体内研究和这种创新治疗方法的潜在临床转化奠定了坚实的机制基础。
3.7 体内荧光成像及早期免疫激活
SGPF纳米系统在材料表征和细胞试验中表现出卓越的荧光成像能力、光热/光动力性能和免疫刺激效果。为了评估其用于术中成像和体内抗肿瘤免疫的功效，对携带LM8皮下肿瘤的C3H小鼠进行了各种处理。
